ENZYMATICKÁ AKTIVITA: JEDNOTKA, MĚŘENÍ, REGULACE A FAKTORY - CHEMIE - 2025

Enzymatická aktivita je způsob, jak vyjádřit množství enzymu přítomného v daném čase. Označuje množství substrátu transformovaného na produkt katalytickým působením enzymu na jednotku času.

Je to ovlivněno podmínkami, za kterých dochází k enzymatické reakci, a proto se obvykle vztahuje na teplotu, při které se měří. Co jsou to enzymy? Jsou to biologické katalyzátory, schopné urychlit rychlost reakce, aniž by během katalyzovaného procesu došlo k nevratné změně.

Ananas nebo ananas, ovoce, které obsahuje enzym bromelain, a proto vykazuje vysokou enzymatickou aktivitu Zdroj: H. Zell

Enzymy jsou obecně proteiny s výjimkou ribozomů, RNA molekuly s enzymatickou aktivitou.

Enzymy zvyšují rychlost reakce snížením energetické bariéry (aktivační energie); to musí vypršet, aby se dosáhlo přechodného stavu, a tak dojde k reakci.

Molekuly substrátu, které dosáhnou přechodného stavu, podléhají strukturálním změnám, které je vedou k vzniku molekul produktu. Na základě funkcí, které plní, jsou enzymy klasifikovány do šesti velkých skupin: oxyreduktázy, transferázy, hydrolázy, lyázy, izomerázy a ligázy.

Enzymy bromelain a papain jsou například proteolytické enzymy (hydrolázy), které se nacházejí v ananasu nebo ananasu, respektive papaya nebo papaya.

Je známo, že ananas i papája usnadňují trávicí proces, protože působením proteolytických enzymů, které obsahují, pomáhají trávit proteiny z, tj. Z masa a zrn.

Jednotka enzymové aktivity

Enzymatická jednotka (IU) je množství enzymu, které katalyzuje přeměnu 1 umol substrátu během jedné minuty.

Následně mezinárodní systém jednotek (SI) definoval jednotku enzymatické aktivity jako množství enzymu, které přemění 1 mol substrátu na produkt za sekundu. Tato jednotka obdržela jméno katal (kat).

1 mol = 10 ⁶ umol a 1 minuta = 60 sekund.

Proto 1 katal se rovná 60 x 10 ⁶ IU. Protože katal je velká jednotka, často se používají menší jednotky, jako například: mikrokatal (µkat), ^10-6 katal a nanokatal (πkat), ^10-9 katal.

Specifická činnost

Je to počet jednotek enzymatické aktivity dělený miligramy proteinu ve zkoušeném vzorku. Specifická aktivita přímo souvisí se stupněm purifikace enzymu.

Jak se měří enzymová aktivita?

Existuje několik metod pro stanovení aktivity enzymu. Výběr konkrétní metody bude záviset na cíli enzymatického testu; použitelnost metody; přístup k vybavení nezbytnému pro provádění experimentu; náklady na použití konkrétní metody atd.

Existují spektrofotometrické, fluorometrické, chemiluminiscenční, kalorimetrické, radiometrické a chromatografické metody.

Spektrofotometrické metody mohou být kolorimetrické a odečítány v ultrafialové (UV) oblasti elektromagnetického záření.

- Kolorimetrická metoda

Je založen na tvorbě chromoforu enzymatickým působením. Enzymatickou aktivitu lze sledovat nepřetržitě nebo diskontinuálně.

Souvislá forma

V kontinuální formě jsou reagencie umístěny do kyvety ve spektrofotometru při požadované vlnové délce, která odpovídá té, ve které má chromofor maximální hodnotu optické hustoty; a že kromě toho nedochází k interferenci s jinou látkou, která může být vytvořena.

Enzymatická reakce se zahajuje přidáním vzorku obsahujícího enzym, jehož aktivita se stanoví. Současně se spustí stopky a čas od času se zaznamená hodnota optické hustoty.

Protože je známa ekvivalence optické hustoty s moly substrátu nebo produktem enzymatického působení, lze v závislosti na použité technice vypočítat moly spotřebovaného substrátu nebo vytvořené moly.

Kromě toho, protože se měří uplynulý čas enzymatické reakce, lze získat moly spotřebované nebo produkované za sekundu. Enzymatická aktivita je tedy stanovena v katálních jednotkách.

Nespojitý tvar

V dávkové formě pro stanovení enzymatické aktivity se zkumavky se složkami reakce, s výjimkou vzorku obsahujícího enzym nebo jinou složku, umístí do lázně při 37 ° C. Reakce se poté zahajuje přidáním chybějící složky.

Doba uvedená technikou se nechá nastat a reakce se ukončí přidáním sloučeniny, která zastaví reakci. V tomto okamžiku se odečte optická hustota a nakonec se stanoví enzymatická aktivita stejným způsobem jako kontinuálním způsobem.

- Metoda měření v ultrafialovém světle

Koenzym nikotinamidadinukleotid má například dvě formy: NADH (redukovaný) a NAD ⁺ (oxidovaný). Podobně má koenzym nikotinamityinukleotidfosfát dvě formy NADPH a NADP ⁺, redukované a oxidované.

Jak redukovaná, tak oxidovaná forma koenzymu se odečítají v délce 260 nm z ultrafialového světla; Mezitím se od ultrafialového světla odečtou pouze redukované formy v délce 340 nm.

Proto jsou jak v oxidačních, tak redukčních reakcích, kterých se účastní jmenované koenzymy, odečteny při 340 nm.

Stanovení enzymatické aktivity je v podstatě stejné jako stanovení v kontinuální formě kolorimetrické metody; kromě toho, že se odečte optická hustota při 340 nm, aby se pozorovalo generování NADH nebo NADPH nebo změřila spotřeba těchto koenzymů.

To bude záviset na tom, zda je měřenou reakcí oxidace nebo redukce. Prostřednictvím korelace mezi optickou hustotou a molem NADH a NADPH může být enzymatická aktivita vypočtena dělením molů koenzymu uplynulým časem v sekundách.

Regulace enzymatické aktivity

Kontrola na úrovni substrátu nebo produktu

S rostoucí koncentrací substrátu se zvyšuje aktivita enzymu. Ale při určité koncentraci substrátu je aktivní místo nebo aktivní místa enzymu nasyceno, takže aktivita enzymu se stává konstantní.

Produkt enzymatického působení však může také interagovat s aktivními místy enzymu, což vede k inhibici enzymatické aktivity.

Produkt může působit jako konkurenční inhibitor; například může být uveden enzym hexokináza. Tento enzym produkuje fosforylaci glukózy, čímž vzniká glukóza-6-fosfát, sloučenina, která, když se akumuluje, inhibuje hexokinázu.

Zpětná vazba

Může se stát, že skupina enzymů (A, B, C, D, E a F) působí postupně v metabolické cestě. Enzym B používá produkt enzymu A jako substrát atd.

Buňka může v závislosti na svých metabolických požadavcích aktivovat nebo inhibovat sekvence enzymatických aktivit. Například akumulace produktu enzymu F může působit inhibicí enzymu A nebo jakéhokoli jiného enzymu v sekvenci.

Allosterické enzymy

Enzym může být tvořen několika podjednotkami, každá s příslušnými aktivními místy. Tyto podjednotky však nepůsobí nezávisle, takže aktivita jedné z podjednotek může aktivovat nebo inhibovat činnost ostatních.

Ačkoli hemoglobin není považován za enzym, je to nádherný model pro jev allosterismu. Hemoglobin je tvořen čtyřmi proteinovými řetězci, dvěma α řetězci a dvěma p řetězci, z nichž každý je připojen ke skupině hem.

Mezi podjednotkami se mohou vyskytnout dva jevy: homoalosterismus a heteroalosterismus.

Homoalosterismus

Vazba substrátu k jedné z podjednotek zvyšuje afinitu ostatních podjednotek pro substrát, což zase zvyšuje enzymatickou aktivitu každé ze zbývajících podjednotek.

Podobně inhibice enzymatické aktivity v jedné z podjednotek vyvolává stejný účinek ve zbytku.

V případě hemoglobinu bude vazba kyslíku na hemovou skupinu jednoho z proteinových řetězců způsobit zvýšení avidity kyslíku ve zbývajících řetězcích.

Podobně uvolňování kyslíku ze skupiny hem způsobuje uvolňování kyslíku ze zbývajících skupin proteinových řetězců.

Heterolosterismus

Vazba aktivační nebo inhibiční látky, jiné než substrátu, na jednu z podjednotek způsobí aktivaci nebo inhibici enzymatické aktivity v ostatních podjednotkách.

V případě hemoglobinu, vazbu na heme skupině H ⁺, CO ₂ a 2,3-diphosphoglycerate k jednomu z podjednotek, snižuje afinitu heme skupiny pro kyslík, což způsobuje jeho uvolňování. Toto uvolňování kyslíku je také produkováno v dalších řetězcích hemoglobinu.

Faktory ovlivňující enzymatickou aktivitu

- Koncentrace substrátu

Jak se zvyšuje koncentrace substrátu, zvyšuje se také enzymatická aktivita. Je to kvůli zvýšenému přístupu molekul substrátu k aktivním místům enzymu.

Pro danou koncentraci substrátu jsou však všechna aktivní místa enzymu nasycena, což způsobuje, že se enzymatická aktivita nezvýší, i když se koncentrace substrátu zvýší.

-pH z enzymatické reakce

Enzymy mají optimální pH, při kterém je afinita enzymu k substrátu nejvyšší. Při tomto pH je dosaženo maximální hodnoty enzymatické aktivity.

Nadměrná kyselost nebo zásaditost média může způsobit denaturaci enzymu, což následně snižuje jeho aktivitu.

Profil pH enzymatické aktivity je různý. Například pepsin má maximální aktivitu mezi 1 až 2 jednotkami pH; trypsin má optimální pH 8; a papain má konstantní aktivitu mezi rozsahem pH mezi 4 a 8.

- Teplota enzymatické reakce

Enzymatická aktivita se zvyšuje s rostoucí teplotou. Obecně se aktivita enzymu zdvojnásobí na každých 10 stupňů zvýšení, dokud není dosaženo optimální teploty pro aktivitu enzymu.

Když je však překročena optimální teplota, má enzymatická aktivita tendenci klesat se zvyšující se teplotou reakce. Důvodem je skutečnost, že proteiny, a tedy enzymy, podléhají denaturaci v důsledku nadměrného zvýšení teploty.

-Ionická koncentrace reakce

Enzymy mají obecně optimální aktivitu v koncentračním rozmezí mezi 0 a 500 mmol / L. Avšak pro vyšší koncentrace má enzymatická aktivita tendenci klesat.

Za těchto okolností jsou blokovány určité iontové interakce v enzymech, které jsou nezbytné pro jejich maximální aktivitu.

Reference

1. Segel, IH (1975). Biochemické výpočty. (^2. vydání). John Wiley & Sons, INC
2. Lehninger, AL (1975). Biochemie. (^2. vydání). Worth Publishers, vč.
3. Mathews, CK, van Holde, KE a Ahern, KG (2002). Biochemie. (3 ^ra Edition). Pearson Addison Weshley.
4. Wikipedia. (2019). Enzymatický test. Obnoveno z: en.wikipedia.org
5. González Juan Manuel. (sf). Kinetický enzym. Kurz biomolekul. Obnoveno z: ehu.eus