RESTRIKČNÍ ENZYMY: FUNKCE, TYPY A PŘÍKLADY - BIOLOGIE - 2025

Tyto restrikční enzymy jsou endonukleáz určitým archea a bakterií k inhibici nebo „omezení“ šíření virů dovnitř. Obzvláště se vyskytují u bakterií a jsou součástí jejich obranného systému proti cizí DNA známé jako restrikční / modifikační systém.

Tyto enzymy katalyzují štěpení dvojpásmové DNA na specifických místech, reprodukovatelně a bez použití další energie. Většina vyžaduje přítomnost kofaktorů, jako je hořčík nebo jiné dvojmocné kationty, i když některé také vyžadují ATP nebo S-adenosylmetionin.

Schéma reakce restrikčních enzymů HindIII (Zdroj: Helixitta prostřednictvím Wikimedia Commons)

Restrikční endonukleázy byly objeveny v roce 1978 Danielem Nathansem, Arberem Wernerem a Hamiltonem Smithem, kteří za jejich objev obdrželi Nobelovu cenu za medicínu. Jejich jméno obecně pochází z organismu, kde jsou poprvé pozorovány.

Tyto enzymy se široce používají při vývoji metod klonování DNA a dalších strategií molekulární biologie a genetického inženýrství. Jejich specifické charakteristiky rozpoznávání sekvencí a schopnost řezat sekvence blízko rozpoznávacích míst z nich činí silné nástroje v genetickém experimentování.

Fragmenty generované restrikčními enzymy, které působily na konkrétní molekulu DNA, lze použít k opětovnému vytvoření „mapy“ původní molekuly pomocí informací o místech, kde enzym štěpil DNA.

Některé restrikční enzymy mohou mít na DNA stejné rozpoznávací místo, ale nutně jej neřežou stejným způsobem. Existují tedy enzymy, které štěpí opouštějící tupé konce, a enzymy, které štěpí opouštějící kohezivní konce, které mají různé aplikace v molekulární biologii.

V současné době existují stovky různých komerčně dostupných restrikčních enzymů nabízených různými komerčními domy; Tyto enzymy fungují jako „vlastní“ molekulární nůžky pro různé účely.

Funkce

Restrikční enzymy plní opačnou funkci polymeráz, protože hydrolyzují nebo narušují esterovou vazbu uvnitř fosfodiesterové vazby mezi sousedními nukleotidy v nukleotidovém řetězci.

V molekulární biologii a genetickém inženýrství jsou široce používanými nástroji pro konstrukci expresních a klonovacích vektorů a pro identifikaci specifických sekvencí. Jsou také užitečné pro konstrukci rekombinantních genomů a mají velký biotechnologický potenciál.

Nedávné pokroky v genové terapii v současné době využívají restrikční enzymy pro zavedení konkrétních genů do vektorů, které jsou nositeli transportu takových genů do živých buněk a které pravděpodobně mají schopnost vložit se do buněčného genomu, aby mohly provádět trvalé změny.

Mechanismus účinku

Restrikční enzymy mohou katalyzovat dvojpásmové štěpení DNA, i když některé jsou schopné rozpoznávat jednopásmové sekvence DNA a dokonce i RNA. Řezání nastane po rozpoznání sekvencí.

Mechanismus účinku spočívá v hydrolýze fosfodiesterové vazby mezi fosfátovou skupinou a deoxyribózou v kostře každého řetězce DNA. Mnoho enzymů je schopno stříhat na stejném místě, které rozpoznají, zatímco jiné štěpí mezi 5 a 9 páry bází před nebo za ním.

Tyto enzymy se normálně štěpí na 5 'konci fosfátové skupiny, což vede k fragmentům DNA s 5' fosforylovým koncem a 3 'koncovým hydroxylovým koncem.

Protože proteiny nepřicházejí do přímého kontaktu s rozpoznávacím místem v DNA, musí být translokovány postupně, dokud není dosaženo specifického místa, snad pomocí „posuvných“ mechanismů na řetězci DNA.

Během enzymatického štěpení je fosfodiesterová vazba každého z řetězců DNA umístěna v jednom z aktivních míst restrikčních enzymů. Když enzym opouští rozpoznávací a štěpné místo, činí tak prostřednictvím nespecifických přechodných asociací.

Typy

V současné době je známo pět typů restrikčních enzymů. Zde je krátký popis každého z nich:

Restrikční enzymy typu I

Tyto enzymy jsou velké pentamerické proteiny se třemi podjednotkami, jedna pro restrikci, druhá pro methylaci a druhá pro rozpoznávání sekvence v DNA. Tyto endonukleázy jsou multifunkční proteiny schopné katalyzovat restrikční a modifikační reakce, mají ATPázovou aktivitu a také DNA topoisomerázu.

Enzymy tohoto typu byly prvními endonukleázami, které byly objeveny, byly poprvé purifikovány v 60. letech a od té doby byly studovány ve velké hloubce.

Enzymy typu I nejsou široce používány jako biotechnologický nástroj, protože místo štěpení může být ve variabilní vzdálenosti až 1 000 párů bází od rozpoznávacího místa, což je činí nespolehlivými z hlediska experimentální reprodukovatelnosti.

Restrikční enzymy typu II

Jsou to enzymy složené z homodimerů nebo tetramerů, které štěpí DNA na definovaných místech o délce 4 až 8 bp. Tato místa štěpení jsou obvykle palindromická, to znamená, že rozpoznávají sekvence, které jsou čteny stejným způsobem v obou směrech.

Mnoho restrikčních enzymů typu II v bakteriích štěpí DNA, když rozpoznají její cizí charakter, protože nemá typické modifikace, které by měla mít její vlastní DNA.

Jedná se o nejjednodušší restrikční enzymy, protože nevyžadují žádný jiný kofaktor než hořčík (Mg +), aby rozpoznaly a štěpily DNA sekvence.

Přesnost restrikčních enzymů typu II při rozpoznávání a řezání jednoduchých sekvencí v DNA v přesných polohách z nich činí jednu z nejrozšířenějších a nezbytných ve většině odvětví molekulární biologie.

Ve skupině restrikčních enzymů typu II existuje několik podtříd klasifikovaných podle určitých vlastností, které jsou pro každou z nich jedinečné. Klasifikace těchto enzymů se provádí přidáním písmen abecedy, od A po Z za názvem enzymu.

Některé z podtříd nejlépe známé pro jejich užitečnost jsou:

Podtřída IIA

Jsou to dimery různých podjednotek. Rozpoznávají asymetrické sekvence a používají se jako ideální prekurzory pro generování řezných enzymů.

Podtřída IIB

Jsou tvořeny jedním nebo více dimery a nařezanými DNA na obou stranách rozpoznávací sekvence. Řezají oba řetězce DNA o interval párů bází před rozpoznávacím místem.

Podtřída IIC

Enzymy tohoto typu jsou polypeptidy s funkcemi dělení a modifikace řetězců DNA. Tyto enzymy štěpí oba řetězce asymetricky.

Podtřída IIE

Enzymy této podtřídy jsou nejpoužívanější v genetickém inženýrství. Mají katalytické místo a obvykle vyžadují alosterický efektor. Tyto enzymy potřebují interagovat se dvěma kopiemi své rozpoznávací sekvence, aby provedly účinné štěpení. V této podtřídě jsou enzymy EcoRII a EcoRI.

Restrikční enzymy typu III

Restrikční endonukleázy typu III se skládají pouze ze dvou podjednotek, jedna je zodpovědná za rozpoznávání a modifikaci DNA, zatímco druhá je zodpovědná za štěpení sekvence.

Tyto enzymy vyžadují pro svoji funkci dva kofaktory: ATP a hořčík. Restrikční enzymy tohoto typu mají dvě asymetrická rozpoznávací místa, translokují DNA způsobem závislým na ATP a rozštěpí ji mezi 20 až 30 bp sousedící s rozpoznávacím místem.

Restrikční enzymy typu IV

Enzymy typu IV se snadno identifikují, protože štěpí DNA methylačními značkami, jsou tvořeny několika různými podjednotkami, které jsou zodpovědné za rozpoznávání a řezání sekvence DNA. Tyto enzymy používají jako kofaktory GTP a dvojmocný hořčík.

Specifická štěpná místa zahrnují nukleotidová vlákna s methylovanými nebo hydroxymethylovanými zbytky cytosinu na jednom nebo obou řetězcích nukleových kyselin.

Restrikční enzymy typu V

Tato klasifikace seskupuje enzymy typu CRISPER-Cas, které identifikují a odříznou specifické sekvence DNA od napadajících organismů. Enzymy Cas používají vlákno CRISPER syntetizované naváděcí RNA k rozpoznání a napadení napadajících organismů.

Enzymy klasifikované jako typ V jsou polypeptidy strukturované podle enzymů typu I, II a II. Mohou řezat části DNA téměř jakéhokoli organismu a se širokým rozsahem délky. Díky jejich flexibilitě a snadnosti použití jsou tyto enzymy jedním z nejpoužívanějších nástrojů v genetickém inženýrství dnes spolu s enzymy typu II.

Příklady

Restrikční enzymy byly použity pro detekci polymorfismů DNA, zejména v populačních genetických studiích a evolučních studiích s použitím mitochondriální DNA, aby se získaly informace o míře substitucí nukleotidů.

V současné době vektory používané pro transformaci bakterií pro různé účely mají multiklonovací místa, kde jsou nalezena rozpoznávací místa pro více restrikčních enzymů.

Z těchto enzymů jsou nejoblíbenější EcoRI, II, III, IV a V, které byly poprvé získány a popsány z E. coli; HindIII z H. influenzae a BamHI z B. amyloliquefaciens.

Reference

1. Bickle, TA, a Kruger, DH (1993). Biologie restrikce DNA. Microbiological Reviews, 57 (2), 434–450.
2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, DA a Horvath, P. (2007). CRISPR poskytuje získanou odolnost proti virům v prokaryotech. Science, 315 (březen), 1709–1713.
3. Goodsell, D. (2002). Molekulární perspektiva: Restrikční endonukleázy. Stem Cells Základy rakovinové medicíny, 20, 190–191.
4. Halford, SE (2001). Poskakování, skákání a opakování restrikčními enzymy. Biochemical Society Transactions, 29, 363-373.
5. Jeltsch, A. (2003). Zachování druhové identity a kontrola speciace bakterií: nová funkce pro restrikční / modifikační systémy? Gene, 317, 13-16.
6. Krebs, J., Goldstein, E., & Kilpatrick, S. (2018). Lewin's Genes XII (12 ed.). Burlington, Massachusetts: Jones & Bartlett Learning.
7. Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N.,… Ona, Q. (2015). Využití systémů CRISPR-Cas typu I a typu III pro editaci genomu. Nucleic Acids Research, 1-12.
8. Loenen, WAM, Dryden, DTF, Raleigh, EA a Wilson, GG (2013). Restrikční enzymy typu I a jejich příbuzní. Nucleic Acids Research, 1–25.
9. Nathans, D., & Smith, HO (1975). Restrikce Endonukleázy v analýze a restrukturalizaci molekul DNA. Annu. Biochem., 273–293.
10. Nei, M., a Tajima, F. (1981). Dna polymorfismus detekovatelný restrikčními endonukleázami. Genetics, 145-163.
11. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. a Wende, W. (2005). Omezující endonukleázy typu II a molekulárních věd o životě Typ: struktura a mechanismus. CMLS Cellular and Molecular Life Sciences, 62, 685–707.
12. Roberts, R. (2005). Jak se restrikční enzymy staly pracovníky molekulární biologie. PNAS, 102 (17), 5905–5908.
13. Roberts, RJ, a Murray, K. (1976). Restrikční endonukleázy. Critical Reviews in Biochemistry, (listopad), 123-164.
14. Stoddard, BL (2005). Naváděcí struktura a funkce endonukleázy. Čtvrtletní přehledy biofyziky, 1-47.
15. Tock, MR, a Dryden, DTF (2005). Biologie restrikce a anti-restrikce. Current Opinion in Microbiology, 8, 466–472.
16. Wilson, GG a Murray, NE (1991). Omezovací a modifikační systémy. Annu. Genet. 25, 585-627.
17. Wu, Z., a Mou, K. (2016). Genomické vhledy do virulence Campylobacter jejuni a populační genetiky. Infec. Dis. Transl. Med., 2 (3), 109–119.
18. Yuan, R. (1981). Struktura a mechanismus multifunkčních restrikčních endonukleáz. Annu. Biochem. 50, 285 až 315.