BIURET: ZDŮVODNĚNÍ, ČINIDLA, POSTUP, POUŽITÍ - BIOLOGIE - 2025

Biuretu je činidlo používá pro stanovení proteinů s dlouhým řetězcem a s krátkým řetězcem. Používá se zejména v oblasti analytické chemie a analýzy moči ke zkoumání koncentrace celkových bílkovin v séru, plazmě a moči.

U některých patologií lze hodnoty proteinu zvýšit nebo snížit. Symptomy hypoproteinémie se obvykle vyskytují u pacientů s onemocněním ledvin, u podvyživených pacientů au pacientů s chronickými infekcemi.

Chemická struktura komplexu vytvořeného při Biuretově reakci Pozitivní Biuretův test. Zdroj: Yikrazuul / flickr

Zatímco hyperproteinémie je pozorována mimo jiné v patologiích, jako je mnohočetný myelom, systémový lupus erythematodes, bakteriální endokarditida, bakteriální meningitida, Waldenstromova makroglobulinemie.

Na druhé straně je přítomnost proteinu v moči způsobena filtrací albuminu ledvinami. Toto je patologické chování, které je třeba zkoumat.

V tomto smyslu je Biuret velmi užitečný, protože umožňuje kvantifikovat přítomnost proteinů v séru, plazmě, moči mezi mnoha dalšími vzorky.

Dokonce i Biuret lze použít ke zkoumání přítomnosti a koncentrace proteinů ve špatně prozkoumaných vzorcích nebo vzorcích neznámého složení. Proto je široce používán v oblasti výzkumu.

Biuretův test je založen na detekci peptidových vazeb. Test se provádí v alkalickém prostředí. Vzorek musí obsahovat alespoň dvě peptidové vazby, aby se vytvořil fialově fialový komplex. Komplex je tvořen spojením vazeb a iontů mědi.

Základ

Biuretovo činidlo se skládá z hydroxidu draselného, ​​síranu měďnatého a tartanu sodného a draselného. Hydroxid sodný se používá k alkalizaci média, protože tato podmínka je nezbytná pro uskutečnění reakce.

Látky, které reagují s proteiny, jsou síran měďnatý, zatímco vínan sodný má funkci, která neumožňuje tvorbu hydroxidu měďnatého, který má tendenci se vysrážet a narušovat reakci.

Pokud jsou ve vzorku nalezeny látky s peptidovými vazbami (polypeptidy nebo proteiny), bude test pozitivní.

Reakce je interpretována jako pozitivní, když roztok zčervená. Barva se vytvoří vytvořením komplexu mezi alespoň dvěma peptidovými vazbami, které mají skupinu CO-NH a měďnaté kationty.

Fialový komplex může být vytvořen dvěma způsoby: jedním je ztráta protonů z amidových skupin, které se vážou na kov (depronotace), a druhým spojením kyslíkových a dusíkových elektronů, které jsou volné a vážou se s mědí.

Tato reakce se může lišit v intenzitě a barvě v závislosti na typu proteinu.

Test může být proveden kvalitativně nebo kvantitativně. V kvalitativní podobě se uvádí jako pozitivní nebo negativní. Zatímco v kvantitativní formě může být koncentrace měřena spektrofotometrickou metodou.

Reakce se odečítá mezi 540 - 560 nm. Intenzita barvy je přímo úměrná koncentraci peptidových vazeb ve vzorku.

Činidla

-20% hydroxid sodný (NaOH)

- pentahydrát síranu vápenatého 1% (CuSO _4, 5 H ₂ O)

-Směs sodného a vinan draselný tetrahydrát (KNAC ₄ H ₄ O ₆ · 4H ₂ O)

Stabilita činidla Biuret

- Musí být uchováván v chladu.

Proces

Technika

- Vložte 100 µl vzorku nebo standardu, který má být analyzován, do zkumavky.

- Přidejte 2 ml hydroxidu sodného.

-Mix velmi dobře.

- Přidejte 5 ml Biuretova činidla.

-Míchat a nechat odpočívat po dobu 25 minut při pokojové teplotě, přikrýt a chránit před světlem.

-Zabezpečte tvorbu nebo ne zbarvení a změřte spektrofotometricky.

Kalibrační křivka

Hovězí sérový albumin lze použít jako standard k provedení kalibrační křivky. Z toho se připravují různé koncentrace. Například 25, 50, 75, 100, 125 a 150%.

Reakce se nastaví se všemi těmito známými koncentracemi a absorbance se odečte při vlnové délce 540 nm. Na základě údajů o známých koncentracích a hodnotách absorbance se provede kalibrační křivka.

Při každém stanovení nebo šarži zpracovaných vzorků se doporučuje připojit standard. Jako kalibrační standard lze použít hovězí sérový albumin 0,1-2 mg / ml.

Měření se provádí na spektrofotometru při 540 nm.

Linearita se dosáhne až do koncentrace 12 g / dl.

Rušení

Látky, které interferují s testem Biuret

Přestože to není příliš časté, je třeba poznamenat, že některé látky mohou během provádění tohoto testu interferovat. Například přítomnost amoniaku může inhibovat tvorbu zbarvení.

Podobně jiné látky by mohly absorbovat při stejné vlnové délce, jako například některé pigmenty.

Na druhé straně může dojít k interferenci, když jiná látka než peptidová vazba tvoří komplex s měďnatou solí. Příklad: některé uhlohydráty a některé lipidy.

V případě, že vzorek, který má být analyzován, obsahuje nějaký typ sraženiny, musí být před montáží zkoušky filtrován nebo odstředěn.

Látky, které nezasahují do testu Biuret

Zkouška není ovlivněna přítomností:

-Bilirubin až do koncentrace 20 mg / dl.

-Hemoglobin až do koncentrace 750 mg / dl.

-Dextran až do koncentrace 30 g / l.

-Triglyceridy až do koncentrace 4000 mg / dl.

Výhoda

-Je to jednoduchá metoda provedení.

-Je to ekonomický test.

-Má vysokou specificitu pro proteiny.

- Malé rušení.

Nevýhody

Má nízkou citlivost k detekci nízkého množství proteinu. Práce, kterou provedli Fuentes et al., Potvrzují, že testovací metoda Biuret má detekční limit 1 mg / ml proteinu a kvantifikační limit 3 mg / ml.

Jiné výzkumy prováděné na Amazonské univerzitě však uvádějí mnohem nižší hodnoty. Detekční limit uváděný ve studii je 0,020 mg / ml a kvantifikační limit je 1,33 mg / ml.

Aplikace

Biuretovo činidlo nebo test se používá pro stanovení bílkovin v klinických a neklinických vzorcích v rutinních a výzkumných laboratořích.

Patologie, ke kterým dochází při nárůstu nebo poklesu

V mnoha patologiích je důležité stanovit koncentraci celkových proteinů v klinických vzorcích, které mohou být zvýšeny nebo sníženy.

Jsou povýšeny na:

-Mnohočetný myelom, - systémový lupus erythematodes, - bakteriální endokarditida, - bakteriální meningitida, Waldenstromova makroglobulinémie, mimo jiné.

Snižuje se v:

- Renální nedostatečnost, - Lidé s těžkým stupněm podvýživy, - Pacienti s chronickými infekcemi, mimo jiné.

Klinické vzorky

Nejběžnějšími klinickými vzorky jsou sérum, plazma a moč. Normální hodnota proteinů v séru nebo plazmě je 6,0 - 8,8 g / dl.

Koncentrace proteinů v moči u dospělých nepřekračuje hodnotu 150 mg / 24 hodin.

Poměr bílkovin v moči a kreatininu v moči normální hodnota

Kojenci: <0,50 mg

Děti od 2 let: index: 0,20 mg

Dospělí: <0,2 mg

Neklinické vzorky

Reakci Biuret lze použít pro mnoho typů neklinických vzorků, jako jsou mléčné výrobky, antivenom nebo jakákoli neznámá látka, u které chcete prozkoumat přítomnost proteinů.

Reference

1. Vázquez J, Guerra L, Quintana J, Ramírez J, Fernando Ry Vázquez Y. (2014). Fyzikálně-chemická charakterizace a obsah bílkovin v tekutých extraktech mangrovové ústřice (Crassostrearizophorae). Cuban Journal of Chemistry, 26 (1), 66-74. Citováno 26. června 2019 z http: //scielo.sld
2. Chaparro S, Lara A, Sandoval A, Sosa S, Martínez J, Gil J. Funkční charakterizace mandlí mangových semen (Mangifera indica L.) Revista Ciencia en Desarrollo. 2015; 6 (1): 67-75
3. "Biuret." Wikipedia, encyklopedie zdarma. 19. června 2019, 16:37 UTC. 26. června 2019, 22:18
4. Fuentes F, Quispe I, García J. Standardizace Biuretovy metody pro kvantifikaci celkových proteinů v polyvalentním antibotropním séru produkovaném v Národním centru pro biologické produkty INS. Bol - Inst Nac Salud 2012; 18 (11-12). K dispozici na adrese: repositorio.ins.gob.pe
5. Vítězné laboratoře. Celkové proteiny. Kolorimetrická metoda pro stanovení celkových bílkovin v séru a plazmě. K dispozici na adrese: wiener-lab.com.ar