FOSFÁTOVÝ PUFR (PBS): ZDŮVODNĚNÍ, PŘÍPRAVA A POUŽITÍ - BIOLOGIE - 2025

Fosfátový pufr, fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem nebo BPS je vyrovnávací paměť, izotonický, jehož úkolem je, aby se hodnota pH udržela a osmotický tlak jako blízko k přirozené biologické prostředí (fyziologický). Zkratka PBS znamená fosfátem pufrovaný fyziologický roztok.

PH a osmolarita jsou dva velmi důležité aspekty, které musí být kontrolovány v určitých laboratorních protokolech. V případě pH je nezbytné, aby byl kontrolován, zejména v biochemických reakcích, protože tyto reakce se mohou lišit nebo nemusí být prováděny, pokud jsou reakční složky v nevhodném pH.

PBS fosfátem pufrovaný fyziologický roztok ve dvou různých pH. Zdroj: Pixinio.com

Mezitím je kontrola osmolarity nezbytná zejména při práci s živými buňkami, protože plazmatické membrány buněk reagují podle koncentrace rozpuštěných látek, ve kterých se nacházejí.

Pokud jsou buňky přeneseny do hypertonického média, budou dehydratovány, protože vodní gradient bude transportován na stranu, kde je vyšší koncentrace solutů. Pokud jsou naopak buňky umístěny do hypotonického média, buňky absorbují tekutinu, dokud nejsou lyžovány.

Proto se pufr PBS používá pro laboratorní protokoly, které vyžadují udržování buněk in vitro, čímž se buňky nepoškodí.

PBS je tvořen kombinací solí, jako je chlorid sodný, fosforečnan sodný, chlorid draselný a fosforečnan draselný. Složení PBS se může lišit v závislosti na protokolu.

Základ

V zásadě je funkcí fosfátového pufru udržovat konstantní fyziologické pH spolu s koncentrací elektrolytů, která je podobná koncentraci nalezené uvnitř těla.

V tomto prostředí jsou buňky schopny zůstat stabilní, protože fyziologické podmínky jsou co nejvíce simulovány.

V případě potřeby mohou být do původní formulace PBS přidány další sloučeniny, například přidání EDTA do pufru je užitečné pro promytí červených krvinek v testu křížové inkompatibility.

EDTA zabraňuje štěpení frakce komplementu Cl přítomného v séru a lýze na červené krvinky, to znamená, že zabraňuje falešným výsledkům nekompatibility. EDTA navíc pomáhá disociovat buňky.

Příprava

Množství solí, které musí být zváženy pro přípravu fyziologického roztoku pufrovaného fosfátem PBS, bude záviset na množství, které musí být připraveno:

-Fosfátem pufrovaný zásobní roztok (10x PBS)

Pro jeden litr roztoku:

Vážit:

80,6 g NaCl,

2,2 g KCl, 11,5 g Na ₂ HPO ₄, 2,0 g KH ₂ HPO ₄

Technika přípravy

Těžké soli vložte do kádinky, přidejte dostatek vody (80%) a míchejte na míchací desce s magnetickou tyčinkou, dokud se soli nerozpustí.

Příprava PBS pomocí míchací destičky s magnetickou tyčí. Zdroj: Uživatel: Ruhrfisch, Wikipedia. com

Filtrem se odstraní nerozpuštěné částice. Použijte filtry s póry 0,45 µm. Autoklávujte a asepticky se distribuujte v laminární proudové kapotě ve skleněných nádobách s víky.

10X roztok (koncentrovaný) neupravuje pH. Úprava se provede jednou naředěnou na koncentraci 1X PBS pufru (ředění 1:10).

-Ufufosfátový fyziologický roztok (1X PBS)

1X PBS lze připravit přímo, zvážit odpovídající množství každé soli, nebo jej lze připravit zředěním zásobního roztoku (1:10) sterilní destilovanou vodou.

- Chcete-li přímo připravit jeden litr fyziologického roztoku pufrovaného fosfátovým pufrem 1X PBS, zvažte:

8,06 g NaCl, 0,22 g KCl, Se 1,15 g Na ₂ HPO ₄, Se 0,20 g KH ₂ HPO ₄

Technika přípravy

Pokračujte, jak je vysvětleno v koncentrovaném roztoku. Následně musí být upraveno pH. Za tímto účelem změřte pH a v závislosti na výsledku použijte kyselinu (HC1) nebo bázi (NaOH) ke snížení nebo zvýšení hodnoty pH podle potřeby, dokud není 7,4.

Kyselina nebo báze se přidávají po kapkách, přičemž se sleduje hodnota pH roztoku pomocí pH metru. Filtrujte, autoklávujte a asepticky distribuujte do kónických zkumavek nebo sklenic podle potřeby.

- K přípravě 1X PBS z 10X zásobního roztoku:

Proveďte ředění 1:10. Například pro přípravu 1 litru 1X PBS odměrejte 100 ml zásobního roztoku a přidejte 700 ml sterilní destilované vody. Upravte pH a doplňte množství vody do 1000 ml.

Připravený pufr PBS je bezbarvý a čirý.

Denní PBS lze uchovávat při pokojové teplotě a zbytek v lednici.

Roztoky pro úpravu pH

HCI

Pro 100 ml 1 molární HCL (kyselina chlorovodíková).

Změřte 91 ml destilované vody a vložte ji do kádinky o objemu 250 ml.

Změřte 8,62 ml koncentrované HC1 a pomalu přidávejte do kádinky obsahující vodu (nikdy to nedělejte opačně). Při manipulaci se silnými kyselinami (vysoce žíravými látkami) přijměte příslušná opatření v oblasti biologické bezpečnosti.

Míchejte po dobu 5 minut nejlépe pomocí míchací desky s magnetickou tyčí uvnitř sklenice. Převod na baňce na 100 ml a doplní se na 100 ml destilované H ₂ O.

NaOH

Pro 100 ml NaOH (hydroxid sodný) 10 molárních.

Změřte 40 ml destilované vody a vložte ji do kádinky o objemu 250 ml. Změří se 40 g NaOH a přidá se do vody. Promíchejte pomocí míchací desky s magnetickou tyčí uvnitř sklenice.

Přeneste do odměrné baňky o objemu 100 ml a doplňte destilovanou vodou po značku. Dodržujte předpisy o biologické bezpečnosti, protože tato reakce je exotermická (uvolňuje energii ve formě tepla).

Pokud chcete připravit další množství fosfátového solného roztoku, můžete nahlédnout do následující tabulky:

Zdroj: «Laboratoř virových a lidských genomik, Lékařská fakulta UASLP»

Aplikace

Používá se především v buněčné biologii, imunologii, imunohistochemii, bakteriologii, virologii a výzkumných laboratořích.

Je ideální pro mytí buněk odstředěním (červené krvinky), monovrstvy buněk se promývají spektroskopickou elipsometrickou metodou, při kvantifikaci bakteriálních biofilmů, při udržování buněčných kultur pro viry, jako promývací roztok v nepřímé imunofluorescenční technice a v technikách pro charakterizaci monoklonálních protilátek.

Používá se také k transportu buněk nebo tkání, jako ředidla pro počítání buněk, k přípravě buněčných enzymů (trypsin), jako ředidla pro metodu sušení biomolekul a k přípravě dalších činidel.

Na druhé straně Martin et al. V roce 2006 prokázal, že PBS je užitečný v forenzních vědeckých laboratořích, konkrétně při získávání spermií z vaginálních nátěrů nebo při získávání vaginálních buněk z penisních nátěrů. Tímto způsobem lze zjistit, zda došlo k pohlavnímu styku.

Omezení

- Některé pufry PBS obsahují látku zvanou azid sodný jako konzervační látku. Tato sloučenina může vytvářet výbušné látky, pokud přijde do kontaktu s olovem nebo mědí. Z tohoto důvodu je nutné při likvidaci tohoto činidla po vypouštění do odpadu věnovat zvláštní pozornost. Je-li tímto způsobem odstraněn, musí být přidáno velké množství vody, aby bylo co nejvíce zředěno.

-Zinek by se neměl přidávat do fosfátového pufru, protože způsobuje vysrážení některých solí.

- Wangen a spolupracovníci v roce 2018 určili, že použití PBS nebylo vhodné k mytí primárních buněk akutní myeloidní leukémie (AML) extrahované z periferní krve, protože mnoho buněk se ztratilo lýzou, přičemž došlo k velkému poklesu materiálu protein.

Proto určili, že primární AML buňky by neměly být po skladování v tekutém dusíku promyty PBS.

Reference

1. Coll J. (1993). Diagnostické techniky ve virologii. Ed Díaz de Santos. 360 str
2. Rodríguez M, Ortiz T. Buněčná kultura. Změna média. Katedra normální a patologické cytologie a histologie University of Sevilla. K dispozici na stránkách personal.us.es
3. Příprava fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku (PBS). (2008). Standardní operační postupy (SOPs) Laboratoř lidské a virové genomiky UASLP Lékařská fakulta. K dispozici na adrese: genomica.uaslp.mx
4. "Fosforečnanový pufrový solný roztok." Wikipedia, encyklopedie zdarma. 3. dubna 2019, 19:36 UTC. 13. dubna 2019, 02:57 en.wikipedia.org.
5. Pietrasanta L, Von-Bilderling C. Témata molekulární biofyziky. K dispozici na adrese: users.df.uba.ar
6. Rediar. Manuál. PBS + EDTA. K dispozici na adrese: felsan.com.ar
7. Martin NC, Pirie AA, Ford LV, Callaghan CL, McTurk K, Lucy D, Scrimger DG. Použití fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku pro regeneraci buněk a spermií z výtěrů. Sci Justice. 2006; 46 (3): 179-84. K dispozici na adrese: ncbi.nlm.nih.gov
8. Wangen R, Aasebø E, Trentani A, et al. Metoda konzervace a promývání fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem ovlivňuje protein akutní myeloidní leukémie. Int J Mol Sci. 2018; 19 (1): 296. K dispozici na adrese: ncbi.nlm.nih.gov
9. Martínez R., Gragera R. (2008). Teoretické a praktické základy histochemie. Vrchní rada vědeckých vyšetřování. Madrid. K dispozici na adrese: books.google.co.ve