MOČOVINOVÝ VÝVAR: ZALOŽENÍ, PŘÍPRAVA A POUŽITÍ - BIOLOGIE - 2025

Močovina vývar je kapalné kultivační médium, který se používá k detekci přítomnosti enzymu ureázy v určitých mikroorganismů. Urease je mikrobiální enzym, který je produkován konstitutivním způsobem, tj. Je syntetizován bez ohledu na to, zda je nebo není přítomen substrát, na který působí.

Funkce ureázy souvisí s rozkladem organických sloučenin. Ne všechny mikroorganismy jsou schopny syntetizovat tento enzym, a proto jeho stanovení v laboratoři umožňuje identifikovat určité bakteriální kmeny a dokonce rozlišit mezi druhy stejného rodu.

Negativní a pozitivní test na močovinu. Zdroj: Fotografie pořízená autorem MSc. Marielsa Gil.

Existují dva typy močovinového testu: Stuart a Christensen. Liší se složením a citlivostí. První z nich je speciální pro ukázání velkého množství ureázy produkované druhy rodu Proteus.

Druhá je citlivější a může detekovat malá množství ureázy generované pozdě jinými bakteriálními rody, jako jsou Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus, Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus, Helicobacter a Mycobacterium.

Stuartův močovinový bujón se skládá z močoviny, chloridu sodného, ​​fosforečnanu draselného, ​​fosforečnanu monodraselného, ​​extraktu z kvasinek, fenolové červeně a destilované vody.

Mezitím se Christensenův močovinový vývar nebo agar skládá z peptonů, chloridu sodného, ​​fosforečnanu draselného, ​​glukózy, močoviny, fenolové červeně, destilované vody a agaru. Ta pouze tehdy, je-li to pevné médium.

Základ

Enzymová ureáza hydrolyzuje močovinu za vzniku oxidu uhličitého, vody a dvou molekul amoniaku. Tyto sloučeniny reagují za vzniku konečného produktu zvaného uhličitan amonný.

Stuartův močovinový vývar

Stuartův močovinový vývar je více pufrovaný na pH 6,8. Mikroorganismus proto musí být schopen vytvořit velké množství amoniaku, aby zafarbil na fenolovou červeň. Hodnota pH by měla stoupnout nad 8.

Proto je Stuartův močovinový vývar selektivní pro druhy Proteus, což přináší pozitivní výsledky během 24 až 48 hodin inkubace, a není efektivní pro bakterie, které produkují malé množství ureázy nebo které pomalu hydrolyzují močovinu.

Důvodem je, že druhy Proteus jsou schopné použít močovinu jako zdroj dusíku. Místo toho jiné bakterie produkující ureázu potřebují další zdroj.

Pérez et al. (2002) určili, že Stuartův močovinový vývar byl stejně účinný jako Christensenův močovinový agar při stanovení ureázy v kvasinkových kmenech rodů Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon a Saccharomyces.

Autoři studie tvrdí, že při inkubaci po dobu 24 a 48 hodin dosáhli 100% shody s oběma médii (Stuart a Christensen); s výjimkou toho, že kmeny, které dokázaly proměnit médium na silnou růžovo-fuchsiovou barvu, byly považovány za pozitivní.

Toto vyjasnění je nezbytné, protože Lodder (1970) uvedl, že téměř všechny kvasinky dokážou zkosit agar Christensenovy močoviny na světle růžovou. To je způsobeno skutečností, že mohou hydrolyzovat močovinu v minimálním množství a tvorbou aminů oxidační dekarboxylací aminokyselin na povrchu. To by nemělo být vykládáno jako pozitivní.

Christensenův močovinový agar nebo vývar

Christensenův močovinový vývar nebo agar je méně pufrovaný, protože dokáže detekovat malá množství amoniaku. Kromě toho je toto médium obohaceno peptony a glukózou. Tyto sloučeniny způsobují růst dalších mikroorganismů produkujících ureu, které nerostou ve vývaru Stuart.

Stejně tak test Christensenovy močoviny nabízí rychlejší výsledky, zejména u proteinu Proteus, který je schopen dávat silně pozitivní výsledky za pouhých 30 minut jako minimální a až 6 hodin jako maximální čas.

Zbytek mikroorganismů produkujících ureu dokáže barvu média mírně změnit po 6 hodinách a silně po 24, 48, 72 hodinách nebo více a dokonce i některé kmeny mohou po 5 nebo 6 dnech vyvolat slabé reakce.

Interpretace obou médií (Stuart a Christensen)

Médium je původně žlutooranžové barvy a pozitivní reakce změní barvu média na růžovo-fuchsiovou. Intenzita barvy je přímo úměrná množství vyrobeného amoniaku.

Negativní reakce opustí médium původní barvy, s výjimkou kvasinek, které mohou na Christensenově močovinovém agarovém médiu bledě růžové.

Příprava

Stuartův močovinový vývar

Odvážte potřebné gramy podle údajů obchodní společnosti. Rozpusťte ve sterilní destilované vodě. K rozpuštění nepoužívejte teplo, protože močovina je citlivá na teplo.

K sterilizaci se používá membránová filtrace. K tomu se používá filtr Millipore s póry o průměru 0,45 um. Nepoužívejte autokláv. Jakmile je roztok filtrován, je distribuován do sterilních zkumavek. Aby se dosáhlo spolehlivých výsledků, měl by být převeden mezi 1,5 ml jako minimální množství a 3 ml jako maximální množství na zkumavku.

Před použitím uchovávejte v chladničce a zahřejte.

Pokud není k dispozici metoda filtrace, mělo by se médium okamžitě použít, aby se získaly spolehlivé výsledky.

Další způsob, jak připravit Stuartův močovinový vývar, je následující:

Některé komerční domy prodávají základní médium pro močovinový test, nikoliv včetně močoviny.

Množství uvedené obchodní společností se zváží. Rozpustí se v destilované vodě a sterilizuje se v autoklávu při 121 ° C po dobu 15 minut. Nechá se trochu odpočinout a když je médium teplé, přidá se 100 ml močovinového roztoku připraveného na 20% a sterilizuje se filtrací.

Je distribuován ve sterilních zkumavkách, jak bylo popsáno výše.

Christensenův močovinový agar nebo vývar

- Příprava roztoku močoviny

Naváží se 29 g dehydratované močoviny a rozpustí se ve 100 ml destilované vody. K sterilizaci použijte metodu filtrace. Nepoužívejte autokláv.

-Použijte základní agar

24 g dehydratovaného základního agaru se rozpustí v 950 ml destilované vody. Sterilizujte v autoklávu při 121 ° C po dobu 15 minut. Nechte ji odpočívat, dokud nedosáhne teploty 50 ° C a přidejte dříve připravenou močovinu asepticky.

Nalijte 4-5 ml do sterilních zkumavek a nakloňte, dokud neztuhne. Měl by existovat dlouhý zobák na flétnu.

Toto médium může být také připraveno v kapalné formě.

Aplikace

Test na močovinu je mimořádně účinný při odlišení rodu Proteus od ostatních rodů v čeledi Enterobacteriaceae, vzhledem k rychlé reakci, kterou poskytuje Proteus.

Použitím Christensenovy kompozice pomáhá test rozlišit mezi druhy stejného rodu. Například S. haemolyticus a S. warneri jsou koaguláza-negativní a beta-hemolytický Staphylococcus, liší se však v tom, že S. haemolyticus je močovina negativní a S. warneri je močovina pozitivní.

Na druhé straně McNulty úspěšně použil Christensenův 2% močovinový vývar ke studiu přítomnosti Helicobacter pylori ve vzorcích biopsie odebraných ze žaludeční sliznice (antrální oblast).

O přítomnosti H. pylori svědčí pozitivní test na močovinu. Doba pozorování výsledků je přímo úměrná množství přítomných mikroorganismů.

Jak je vidět, jedná se o jednoduchou metodu pro diagnostiku Helicobacter pylori v žaludečních biopsiích.

Nakonec je tento test také užitečný pro odlišení druhů od rodů Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus a Mycobacteria.

Výsev močové zkoušky

Obě metody vyžadují k optimalizaci výsledků silné mikrobiální inokulum. Bakteriální kolonie se s výhodou odebírají z krevního agaru a kvasinek z agaru Sabouraud, až na několik výjimek. Inokulum je emulgováno v kapalném médiu.

Stuartův močovinový vývar inkubujte při 37 ° C po dobu 24 až 48 hodin s vědomím, že kmeny Proteus hledáte pouze tehdy, když je kmen bakterií. U kvasinek může být inkubována při 37 ° C nebo při pokojové teplotě po dobu 24 až 48 hodin inkubace.

V případě Christensenova močovinového vývaru se inkubuje 24 hodin při 37 ° C. Pokud je test negativní, může být inkubován až 6 dní. Pokud je test pozitivní před 6 hodinami, znamená to, že se jedná o kmen rodu Proteus.

V případě Christensenova močovinového agaru je zkosený agar silně naočkován, bez propíchnutí. Vývar se inkubuje a interpretuje stejným způsobem.

QA

K testování média lze použít kontrolní kmeny, jako je Proteus mirabilis ATCC 43071, Klebsiella pneumoniae ATCC 7006003, Escherichia coli ATCC 25922 a Salmonella typhimurium. První dva by měli dát pozitivní výsledky a poslední dva negativní výsledky.

Zdroj: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. ed. Editorial Panamericana SA Argentina.

Reference

1. Pérez C, Goitía K., Mata S, Hartung C, Colella M, Reyes H. a kol. Použití Stuartova močovinového vývaru pro ureázový test jako test při diagnostice kvasinek. Soc. Ven. Microbiol. 2002; 22 (2): 136 - 140. K dispozici na adrese: Scielo.org.
2. Mac Faddin J. (2003). Biochemické testy pro identifikaci bakterií klinického významu. 3. ed. Editorial Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey a Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
5. Britannia Laboratories. Christensen Medium (základna pro močovinový agar) 2015. Dostupné na: britanialab.com