KMEN (MIKROBIÁLNÍ): CHARAKTERISTIKA, IDENTIFIKACE, IZOLACE - BIOLOGIE - 2025

Mikrobiální kmen je sada potomků z jedné mikrobiální izolátu, který se pěstuje v čistém prostředí, a je obvykle složen z posloupnosti organismů, které jsou odvozeny z téhož počátečního kolonie.

Kmen také představuje soubor jedinců populace mikrobiálních druhů, kteří sdílejí určité fenotypové a / nebo genotypové vlastnosti, které jej mírně odlišují od ostatních stejných druhů, ale jejichž rozdíly nestačí k jejich kategorizaci jako různých druhů.

Fotografie Petriho misky s pevným kultivačním médiem doplněným antibiotiky, kde rostou rezistentní mikroby (Zdroj: Microrao / CC BY-SA (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0) přes Wikimedia Commons)

Kmen je "základem" pro jakoukoli mikrobiologickou studii, protože vědcům zaručuje, že parametry a charakteristiky, které se zkoumají na druhu mikrobu, jsou specifické pouze pro tento druh. Kromě toho jim umožňuje určitým způsobem zajistit reprodukovatelnost vyšetřování.

Například pro taxonomické studie v mikrobiologii je prvním cílem získání „kmene“ organizmu, který má být klasifikován, protože tímto způsobem je možné přesně definovat každou z taxonomických charakteristik, které odlišují tuto podskupinu v rámci populace jednoho druhu jakéhokoli jiného druhu mikrobu.

Kmen umožňuje, aby byl druh mikrobů udržován naživu a izolován in vitro po dlouhou dobu, tedy daleko od jeho přirozeného prostředí. Mohou být získány kmeny mnoha mikroorganismů různých typů, jako jsou bakterie, houby, viry, prvoky, řasy.

Pro udržování kmenů musí být tyto kmeny udržovány v přísné izolaci, která zabraňuje kontaktu kmene s jakýmkoli kontaminujícím činidlem, jako jsou plísňové spory nebo s jakýmkoli vnějším mikroorganismem.

Charakteristiky kmene

Všechny kmeny, bez ohledu na typ mikroorganismu (druhu), který reprezentují, musí splňovat některé základní parametry, mezi něž patří:

- Musí to být stabilní genetické linie nebo musí mít vysokou genetickou věrnost

Je důležité, aby všichni jedinci, kteří zůstávají v kultivačním médiu, byli geneticky mluvící co nejblíže sobě. To znamená, že všichni pocházejí od stejného jednotlivce nebo alespoň ze stejné populace.

- Musí se snadno udržovat nebo růst

Jednotlivci patřící do kmene musí být snadno udržovatelní v prostředí in vitro. Jinými slovy, ne všechny mikroby se dokáží izolovat od svého přirozeného prostředí. Pokud je jejich růst v externích médiích obtížný, lze jejich biologii snadno změnit s minimálními změnami prostředí, ve kterém jsou izolovány v laboratoři.

- Musí mít rychlý růst a vývoj za optimálních podmínek

Pokud se izolované mikroby v kultivačním médiu použitém k tomuto účelu rychle nevyvíjejí, může být obtížné uchovat je pro studium, protože za těchto podmínek mohou vyčerpat živiny ze svého prostředí, změnit fázi nebo ohrozit jejich přežití..

- Musí uvádět definované vlastnosti a parametry

Kmen izolovaných mikroorganismů musí mít společné vlastnosti, které ho identicky a specificky vztahují k jednotlivcům, kteří jsou s ním totožní. Tyto charakteristiky musí být v průběhu času konstantní.

- Snadná manipulace

Obecně kmeny používané při rutinních výzkumech nevyžadují příliš přísné nebo komplikované nástroje nebo protokoly. Tím je zajištěno, že jak studenti, tak noví vědci si mohou v průběhu času udržovat kontinuitu studia.

ID

Molekulární identifikace

Existují různé způsoby identifikace nově izolovaného kmene. V současné době je však nejpřesnější, nejrychlejší a nejjednodušší technikou k určení identity téměř jakéhokoli druhu analýza několika oblastí genetických sekvencí, které tvoří genom jednotlivce.

Obvykle se tyto analýzy provádějí amplifikací specifických oblastí DNA technikou PCR (polymerázová řetězová reakce). Tyto techniky se liší podle okraje, rodiny a typu mikroorganismu, jehož identita je žádoucí. Tyto regiony jsou obecně:

- Oblasti, které kódují ribozomální RNA

- Geny kódující proteinové podjednotky, které se účastní dýchání (zejména pokud je organismus aerobní)

- Genetická oblast, která kóduje aktinová mikrofilamenty (součást cytoskeletu)

- Některé genetické oblasti chloroplastových nebo proteinových podjednotek, které se účastní fotosyntézy (pro některé řasy a sinice a pro všechny rostliny)

Jakmile byly tyto fragmenty genomu úspěšně amplifikovány, jsou sekvenovány pro stanovení pořadí nukleotidů, které tvoří tyto oblasti genomu. To se provádí technikami NGS (Next Generation Sequencing) se specializovaným zařízením známým jako sekvencery.

Sekvenované oblasti jsou porovnány se sekvencemi mikroorganismů tohoto typu, které již byly dříve uvedeny, což je možné například pomocí databáze, která je uložena na webových stránkách GenBank (https: // www. ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).

Morfologická identifikace

V laboratořích, které nemají nástroje molekulární biologie pro analýzu genetických charakteristik, se k identifikaci kmenů mnoha mikroorganismů používají další fenotypové parametry. Zkoušené fenotypové vlastnosti se opět liší v závislosti na organismu, kmenu, rodině a uvažovaném druhu. Mezi tyto parametry jsou studovány:

- Morfologické vlastnosti mikrobu v kultivačním médiu. Mezi další aspekty patří: barva, tvar, textura, typ růstu.

- Analýza metabolických produktů pomocí biochemických nástrojů. Studuje se mimo jiné produkce sekundárních metabolitů, vylučovaných chemických sloučenin.

- Charakterizace a krystalizace proteinů. Vnitřní proteiny mikroorganismů jsou extrahovány a studovány nezávisle.

Typickou věcí v mikrobiologických studiích je provedení charakterizace kmenů s oběma typy identifikace, tj. Morfologickým pozorováním a molekulární analýzou.

Izolace kmenů

Izolace kmenů zahrnuje několik technik, které se také používají k oddělení jednoho druhu mikrobu od jiného. Schopnost izolovat kmen sledovaného druhu je nezbytná pro přesné určení jeho definujících charakteristik.

Většina technik izolace kmene byla vytvořena během 19. století otci mikrobiologie Louisem Pasteurem a Robertem Kochem. Oba byli posedlí snahou získat čisté buněčné kultury (kmeny) mikroorganismů, které studovali.

Zdroj: Sentebrinka / CC BY (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0) přes Wikimedia Commons

K získání těchto buněčných kultur prozkoumali širokou škálu technik a nástrojů, od použití sterilních párátků po změny ve složení kultivačního média, kde byly připraveny růst mikroby, které studovaly.

Techniky izolace kmene

V současné době byly všechny techniky vyvinuté a používané těmito vědci a některé modernější shromážděny do 6 různých typů, kterými jsou:

- Škrábance, škrábance nebo škrábance: pomocí jemného a špičatého nástroje se dotkne místa, kde se nachází mikroorganismus (zejména u kultur pěstovaných in vitro v pevném médiu). Sterilní pevné médium bohaté na živiny je poškrábáno koncem, kterým byl zasažen mikroorganismus.

- Ponoření nebo fúze do média: odebere se malý vzorek mikrobů (může to být jako vzorek odebraný v předchozí technice) a umístí se do růstového média v kapalném stavu, přidá se agar pro ztuhnutí a počkejte, až vychladne. Kolonie budou vidět pouze tehdy, když je mikroorganismus vysoce rozvinutý.

- Sériová ředění: vzorek z původního místa, kde byl druh odebrán, se postupně ředí ve sterilním médiu bez dalších mikroorganismů. Ředění se naočkují na pevná média a očekává se, že se objeví kolonie.

- Exkluzivní kultivační média: jedná se o kultivační média, která umožňují růst pouze požadovaného mikrobu; to znamená, že obsahuje složky nebo živiny, které umožňují izolovat pouze růst kmene.

- Manuální nebo mechanické oddělení: umístí se malý vzorek mikrobu, který má být izolován, a pomocí mikroskopu se provede pokus o oddělení jednoho jednotlivce druhu od zbytku jednotlivců, kteří jej obklopují.

Některé z těchto technik se snadněji používají než jiné. Vědci je však používají podle biologických charakteristik studovaného druhu.

Reference

1. De Kruif, P. (1996). Lovci mikrobů. Houghton Mifflin Harcourt.
2. Dijkshoorn, L., Ursing, BM a Ursing, JB (2000). Kmen, klon a druh: komentáře ke třem základním konceptům bakteriologie. Journal of medical microbiology, 49 (5), 397-401.
3. Marx, V. (2016). Mikrobiologie: cesta k identifikaci na úrovni kmene. Nature Methods, 13 (5), 401-404.
4. Willey, JM, Sherwood, L. a Woolverton, CJ (2009). Prescottovy principy mikrobiologie. Boston (MA): McGraw-Hill Higher Education.
5. Williams, JA (Ed.). (2011). Kmenové inženýrství: metody a protokoly (svazek 765, str. 389-407). New York: Humana Press.