VYSOCE ÚČINNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE (HPLC): ZDŮVODNĚNÍ, VYBAVENÍ, TYPY - CHEMIE - 2025

HPLC je instrumentální technika používaná v chemických analýz, které oddělené směsi se mohou, očistit a kvantifikovat jeho složek, a další studie. Je známa zkratkou HPLC, odvozenou z angličtiny: High Performance Liquid Chromatography.

Jak již název napovídá, funguje tak, že manipuluje s tekutinami. Tyto prostředky sestávají ze směsi složené z analyzovaného vzorku nebo vzorku a jednoho nebo více rozpouštědel, které fungují jako mobilní fáze; to je ten, který protahuje analyt skrz veškeré HPLC zařízení a kolonu.

HPLC zařízení. Zdroj: Dqwyy

HPLC je široce používána laboratořemi pro analýzu kvality v mnoha společnostech; jako jsou léčiva a potraviny. Dotyčný analytik musí připravit vzorek, mobilní fázi, zkontrolovat teplotu a další parametry a umístit lahvičky dovnitř kola nebo karuselu, aby zařízení automaticky provedlo injekce.

Zařízení HPLC je připojeno k počítači, pomocí kterého lze pozorovat generované chromatogramy, a také zahájit analýzy, řídit tok mobilní fáze, programovat typ eluce (izokratický nebo gradient) a zapnout detektory (UV) -Vis nebo hmotnostní spektrofotometr).

Základ

Na rozdíl od konvenční kapalinové chromatografie, jako je sloupcová chromatografie naplněná papírem nebo silikagelem, HPLC nezávisí na gravitaci kapaliny, aby se kapalina zvlhčila stacionární fází. Místo toho pracuje s vysokotlakými čerpadly, která zavlažují mobilní fázi nebo eluent přes kolonu s větší intenzitou.

Tímto způsobem není nutné nalévat mobilní fázi tak často skrze kolonu, ale systém to spíše dělá nepřetržitě a s vyššími průtoky.

Účinnost této techniky však není způsobena výhradně tímto detailem, ale také malými částicemi plniva, které tvoří stacionární fázi. Protože je menší, jeho kontaktní plocha s mobilní fází je větší, takže bude lépe reagovat s analytem a jeho molekuly se budou více separovat.

Tyto dvě vlastnosti plus skutečnost, že tato technika umožňuje spojení detektorů, činí HPLC mnohem lepší než tenkovrstvá nebo papírová chromatografie. Separace jsou účinnější, mobilní fáze cestuje lépe stacionární fází a chromatogramy mohou detekovat jakékoli selhání v analýze.

Zařízení

Zjednodušený diagram činnosti zařízení HPLC. Zdroj: Gabriel Bolívar.

Výše je zjednodušený diagram fungování zařízení HPLC. Rozpouštědla jsou ve svých příslušných nádobách, uspořádaná s hadicemi, takže čerpadlo vezme jejich malý objem do zařízení; máme tedy mobilní fázi.

Mobilní fáze nebo eluent musí být nejprve odplyněny takovým způsobem, aby bubliny neovlivnily separaci molekul analytu, která se smíchá s mobilní fází, jakmile zařízení provede injekce.

Chromatografická kolona je umístěna uvnitř pece, která umožňuje regulovat teplotu. Pro různé vzorky tedy existují dostatečné teploty pro dosažení vysoce výkonných separací, jakož i široký katalog sloupců a typů náplní nebo stacionárních fází pro specifickou analýzu.

Mobilní fáze s rozpuštěným analytem vstupuje do kolony az ní se molekuly, které „pociťují“ menší afinitu ke stacionární fázi, eluují jako první, zatímco ty, které jsou více zadrženy, se eluují později. Každá eluovaná molekula generuje signál zobrazený na chromatogramu, kde jsou pozorovány retenční časy oddělených molekul.

A na druhé straně mobilní fáze po průchodu detektorem končí v kontejneru na odpad.

Typy HPLC

Existuje mnoho typů HPLC, ale mezi všemi nejvýraznějšími jsou následující čtyři.

Chromatografie na normální fázi

Normální fázová chromatografie se týká chromatografie, kde stacionární fáze má polární povahu, zatímco mobilní fáze je nepolární. Ačkoli se to nazývá normální, ve skutečnosti je to nejméně používané, přičemž reverzní fáze je nejrozšířenější a nejúčinnější.

Chromatografie na reverzní fázi

Jako inverzní fáze je nyní stacionární fáze nepolární a mobilní fáze polární. To je zvláště užitečné v biochemické analýze, protože mnoho biomolekul se lépe rozpustí ve vodě a v polárních rozpouštědlech.

Iontoměničová chromatografie

V tomto typu chromatografie se analyt s kladným nebo záporným nábojem pohybuje sloupcem a nahrazuje ionty, které obsahuje. Čím vyšší je náboj, tím vyšší je jeho retence, a proto se široce používá k oddělení iontových komplexů přechodných kovů.

Chromatografie s vyloučením podle velikosti

Tato chromatografie, spíše než separace, je zodpovědná za čištění výsledné směsi. Jak již název napovídá, analyt se již neoddělí podle toho, jak úzce souvisí se stacionární fází, ale podle velikosti a molekulové hmotnosti.

Menší molekuly budou zadrženy více než velké molekuly, protože ty nejsou zachyceny mezi póry náplní polymerních kolon.

Aplikace

HPLC umožňuje kvalitativní i kvantitativní analýzu. Z kvalitativního hlediska lze porovnáním retenčních časů chromatogramu za určitých podmínek detekovat přítomnost konkrétní sloučeniny. Taková přítomnost může naznačovat onemocnění, falšování nebo užívání drog.

Je proto počítačovou součástí diagnostických laboratoří. Podobně se vyskytuje ve farmaceutickém průmyslu, protože umožňuje kontrolovat čistotu produktu a jeho kvalitu s ohledem na jeho rozpouštění v žaludečním prostředí. Výchozí materiály se také podrobí HPLC, aby se čistily a zajistily lepší výkon při syntéze léčiv.

HPLC umožňuje analýzu a separaci komplexních směsí proteinů, aminokyselin, uhlohydrátů, lipidů, porfyrinů, terpenoidů a je v podstatě vynikající volbou pro práci s rostlinnými extrakty.

A konečně, molekulární vylučovací chromatografie umožňuje vybrat polymery různých velikostí, protože některé mohou být menší nebo větší než jiné. Tímto způsobem se získají produkty s nízkou nebo vysokou průměrnou molekulovou hmotností, což je určující faktor v jejich vlastnostech a budoucích aplikacích nebo syntéze.

Reference

1. Day, R., & Underwood, A. (1989). Kvantitativní analytická chemie. (páté vydání). PEARSON Prentice Hall.
2. Bussi Juan. (2007). Vysoce účinná kapalinová chromatografie.. Obnoveno z: fing.edu.uy
3. Wikipedia. (2019). Vysoce účinná kapalinová chromatografie. Obnoveno z: en.wikipedia.org
4. Clark Jim. (2007). Vysoce účinná kapalinová chromatografie. Obnoveno z: chemguide.co.uk
5. Matthew Barkovich. (5. prosince 2019). Vysoce účinná kapalinová chromatografie. Chemistry LibreTexts. Obnoveno z: chem.libretexts.org
6. GP Thomas. (15. dubna 2013). Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC) - metody, výhody a aplikace. Obnoveno z: azom.com