HISTOCHEMIE: ODŮVODNĚNÍ, ZPRACOVÁNÍ, BARVENÍ - BIOLOGIE - 2025

Histochemické je užitečný nástroj při studiu morfologie různých biologických tkání (rostliny a zvířata), vzhledem k jeho reakčního principu tkáňových složek, jako jsou sacharidy, lipidy a proteiny, mimo jiné, v chemických barviv.

Tento cenný nástroj umožňuje nejen identifikovat složení a strukturu tkání a buněk, ale také různé reakce, které se v nich vyskytují. Podobně lze prokázat možné poškození tkáně způsobené přítomností mikroorganismů nebo jiných patologií.

Histochemické skvrny. Virus Nilu, grampozitivní a gramnegativní bakterie (gram), histoplasma capsulatum (Grocott), Mycobacterium tuberculosis (Ziehl Neelsen). Zdroj: Pixinio.com/Wikipedia.org/Nephron / CDC / Dr. George P. Kubica

Histochemie z minulých století poskytla důležité příspěvky, jako je demonstrace existence hematoencefalické bariéry Paulem Ehrlichem. Bylo to možné, protože mozek experimentálního zvířete používaného Ehrlichem nebyl zbarven anilinem, což je základní barvivo.

To vedlo k použití různých barviv, jako je methylenová modř a indofenol, za účelem barvení různých typů buněk. Toto zjištění vedlo ke klasifikaci buněk do acidofilních, bazofilních a neutrofilních podle jejich specifického zbarvení.

Nedávné studie použily tuto techniku ​​k prokázání přítomnosti různých sloučenin, včetně fenolů, stejně jako uhlohydrátů a nestrukturálních lipidů, v tkáních druhu Litsea glaucescens, lépe známého jako vavřín. Nalezení těchto, jak v listu, tak v lese.

Podobně Colares et al, 2016, identifikoval rostlinu léčivého zájmu Tarenaya hassleriana pomocí histochemických technik. U tohoto druhu byla prokázána přítomnost škrobu, myrosinu, jakož i fenolických a lipofilních sloučenin.

Základ

Histochemie je založena na barvení buněčných struktur nebo molekul přítomných v tkáních díky jejich afinitě se specifickými barvivy. Reakce zbarvení těchto struktur nebo molekul v jejich původním formátu je později vizualizována v optickém mikroskopu nebo elektronovém mikroskopu.

Specifičnost barvení je způsobena přítomností skupin přijímajících ionty přítomných v buňkách nebo molekulách tkáně.

A konečně, cílem histochemických reakcí je být schopen ukázat to barvením. Od největších biologických struktur po nejmenší tkáně a buňky. Toho lze dosáhnout díky skutečnosti, že barviva chemicky reagují s molekulami tkání, buněk nebo organel.

Stíhání

Histochemická reakce by mohla zahrnovat kroky před provedením této techniky, jako je fixace, vložení a řezání tkáně. Proto je třeba vzít v úvahu, že v těchto krocích může být identifikovaná struktura poškozena, což vede k falešně negativním výsledkům, i když je přítomna.

Přesto je důležitá předchozí fixace tkáně, protože brání autolýze nebo destrukci buněk. K tomu se mimo jiné používají chemické reakce s organickými rozpouštědly, jako je formaldehyd nebo glutaraldehyd.

Zahrnutí textilie se provádí tak, aby si udržovalo pevnost při řezání a tím bránilo deformaci. Nakonec je řez proveden mikrotomem pro studium vzorků optickou mikroskopií.

Kromě toho se před zahájením histochemického barvení doporučuje do každé šarže testů začlenit externí nebo interní pozitivní kontroly. Stejně jako použití specifických barviv pro studované struktury.

Histochemické skvrny

Od vzniku histochemických technik až po současnost bylo použito široké spektrum skvrn, včetně těch nejčastěji používaných, jako jsou: kyselina jodistá Schiff (PAS), Grocott, Ziehl-Neelsen a Gram.

Stejně tak se méně často používají jiná barviva, například indický inkoust, orcein nebo Massonova trichromová skvrna.

Periodická kyselina Schiff (PAS)

S tímto zbarvením lze pozorovat molekuly s vysokým obsahem uhlohydrátů, jako například: glykogen a mucin. Je však také užitečný pro identifikaci mikroorganismů, jako jsou houby a paraziti. Kromě určitých struktur (bazální membrána) v kůži a dalších tkáních.

Základem tohoto barvení je, že barvivo oxiduje uhlíkové vazby mezi dvěma blízkými hydroxylovými skupinami. To vede k uvolňování aldehydové skupiny, což je detekováno Schiffovým činidlem, čímž se získá fialová barva.

Schiffovo činidlo se skládá ze zásaditého fuchsinu, metabisulfitu sodného a kyseliny chlorovodíkové, přičemž tyto složky jsou zodpovědné za fialové zbarvení, pokud jsou přítomny aldehydové skupiny. Jinak se vytvoří bezbarvá kyselina.

Intenzita zbarvení bude záviset na množství hydroxylových skupin přítomných v monosacharidech. Například u plísní, bazálních membrán, mucinů a glykogenu může barva přecházet z červené na fialovou, zatímco jádra se zbarví modře.

Grocott

Je to jedna ze skvrn s nejvyšší citlivostí při identifikaci hub v tkáních zabudovaných do parafinu. To umožňuje identifikaci různých struktur plísní: mimo jiné hyfy, spory, endospory. Proto se považuje za rutinní skvrnu pro diagnostiku mykózy.

Používá se zejména při diagnostice plicních mykóz, jako je pneumocystóza a aspergilóza způsobená některými houbami rodů Pneumocystis a Aspergillus.

Tento roztok obsahuje dusičnan stříbrný a kyselinu chromovou, přičemž druhá je fixační a barvicí. Důvodem je, že tato kyselina produkuje oxidaci hydroxylových skupin na aldehydy mukopolyacharidy přítomnými ve strukturách hub, například v buněčné stěně hub.

Nakonec je stříbro přítomné v roztoku oxidováno aldehydy, což způsobuje černé zbarvení, které se nazývá argentafinová reakce. Lze také použít kontrastní barviva, jako je například světle zelená, a proto budou houbové struktury pozorovány černě se světle zeleným pozadím.

Ziehl-Neelsen

Toto barvení je založeno na přítomnosti rezistence vůči kyselinám a alkoholu, částečně nebo úplně, v některých mikroorganismech, jako jsou rod Nocardia, Legionella a Mycobacterium.

Doporučuje se použití tohoto barviva, protože buněčná stěna výše uvedených mikroorganismů obsahuje komplexní lipidy, které brání pronikání barviv. Zejména ve vzorcích z dýchacích cest.

V něm se používá silná barviva, jako je karbol fuchsin (základní barvivo) a aplikuje se teplo, takže mikroorganismus si může barvivo uchovat a nezbarví kyselinami a alkoholy. Nakonec se k zabarvení struktur, které se zbarvily, použije roztok methylenové modři.

Přítomnost rezistence vůči kyselině a alkoholu je pozorována u struktur obarvených červeně, zatímco struktury, které neodolávají vyblednutí, jsou obarveny modře.

Gram a čínský inkoust

Gram je mimo jiné velmi užitečnou barvou v diagnostice bakteriálních a plísňových infekcí. Toto zbarvení umožňuje rozlišovat mezi gram-pozitivními a gram-negativními mikroorganismy, což jasně ukazuje rozdíly, které existují ve složení buněčné stěny.

Zatímco indický inkoust je skvrna, která se používá k kontrastním strukturám, které obsahují polysacharidy (kapsle). Je to proto, že v prostředí je vytvořen prsten, což je možné u Cryptococcus neoformans.

Orcein

Tímto zabarvením jsou elastická vlákna a chromozomy různých buněk obarveny, což umožňuje vyhodnocení procesu zrání těchto buněk. Z tohoto důvodu je velmi užitečný v cytogenetických studiích.

To je založeno na absorpci barviva negativním nábojem molekul, jako je DNA, přítomných v jádrech široké škály buněk. Jsou tedy zbarveny modře až tmavě fialově.

Massonův trichrom

Tato skvrna se používá k identifikaci některých mikroorganismů nebo materiálů, které obsahují melanické pigmenty. To je případ mykóz, způsobených dematiaceózními houbami, feohifomykosou a eumycetomem černých zrn.

Závěrečné myšlenky

V posledních letech došlo k mnoha pokrokům ve vytváření nových diagnostických technik, kde je zapojena histochemie, ale souvisí s jinými základními principy nebo principy. Tyto techniky mají jiný účel, jako v případě imunohistochemie nebo enzymohistochemie.

Reference

1. Acuña U, Elguero J. Histoquímica. An. Chem. 2012; 108 (2): 114-118. K dispozici na adrese: are.iqm.csic.es
2. Městanza R. Frekvence histochemických skvrn PAS, Grocott a Ziehl-Neelsen používaných k identifikaci mikroorganismů, provedená v Patologické anatomické službě specializované nemocnice Eugenio Espejo v roce 2015.. Ekvádorská centrální univerzita, Quito; 2016. K dispozici na adrese: dspace.uce.edu
3. Tapia-Torres N, de la Paz-Pérez-Olvera C, Román-Guerrero A, Quintanar-Isaías A, García-Márquez E, Cruz-Sosa F. Histochemie, celkový obsah fenolu a antioxidační aktivita listů a dřeva litsea glaucescens Kunth (Lauraceae). Dřevo a lesy. 2014; 20 (3): 125-137. K dispozici na adrese: redalyc.org
4. Colares, MN, Martínez-Alonso, S, Arambarri, AM. Anatomie a histochemie Tarenaya hassleriana (Cleomaceae), druh léčivého zájmu. Latinskoamerický a karibský bulletin léčivých a aromatických rostlin 2016; 15 (3): 182-191. K dispozici na adrese: redalyc.org
5. Bonifaz A. Základní lékařská mykologie. 4. vydání. Mexiko: McGraw-Hill Interamericana editori, SA de CV 2012.
6. Silva Diego Filipe Bezerra, Santos Hellen Bandeira de Pontes, León Jorge Esquiche, Gomes Daliana Queiroga de Castro, Alves Pollianna Muniz, Nonaka Cassiano Francisco Weege. Klinicko-patologická a imunohistochemická analýza spinocelulárního karcinomu vřetenových buněk jazyka: vzácný případ. Einstein (São Paulo) 2019; 17 (1): eRC4610. K dispozici od: scielo.br