IMUNOFLUORESCENCE: ZDŮVODNĚNÍ, PROTOKOL A APLIKACE - BIOLOGIE - 2025

Imunofluorescence je výkonná technika imunologické barvení pomocí protilátek kovalentně vázané k fluorescenčními molekulami pro identifikaci konkrétních cílů v buněčných vzorků pevných na pevném nosiči.

Tato technika zahrnuje mikroskopické pozorování s imunologickou specifičností, což umožňuje pozorovat živé nebo mrtvé buňky, které mohou představovat nepatrné množství antigenů. Je široce používán jak v oblasti výzkumu, tak při klinické diagnostice různých patologií.

Imunoznačení aktinových vláken v kardiomyocytových buňkách (Zdroj: Ps1415 přes Wikimedia Commons)

Tato technika, zejména kvalitativní (s některými kvantitativními variantami), se musí konkrétně týkat vizualizace vzorku produktovým signálem fluoroforu, což je fluorescenční molekula navázaná na protilátku a která může být excitována při určité vlnové délce.

V buněčném kontextu je velmi užitečné studovat přítomnost / nepřítomnost a subcelulární umístění proteinů. Tato technika byla původně používána v klinickém prostředí pro diagnostiku virů, jako je chřipka a následně pro mnoho dalších infekčních chorob.

Jedná se o vysoce citlivou techniku ​​as vhodným mikroskopickým zařízením může mít velmi dobré rozlišení. K jeho pozorování je třeba použít konfokální nebo epifluorescenční mikroskopy.

Přestože je velmi populární, může představovat některé důležité problémy s ohledem na získání nespecifické fluorescence, která vytváří určitý „šum“ v pozadí, což často omezuje přiměřené čtení výsledků.

Základ

Imunofluorescence je založena na využití biologického jevu interakční reakce mezi protilátkou a antigenem. Musí to dělat konkrétně s vizualizací nebo detekcí této reakce excitací fluorescenčních molekul na specifickou vlnovou délku.

Protilátka je imunoglobulinový protein vylučovaný z aktivních B buněk, který je specificky generován proti antigenu, ke kterému se může vázat s vysokou afinitou a specificitou. Imunofluorescence využívá imunoglobuliny IgG, které jsou rozpustné v krevním séru.

Protilátky jsou molekuly do 950 kDa tvořené dvěma krátkými (lehkými) a dvěma dlouhými (těžkými) peptidovými řetězci ve tvaru „Y“. Jak lehký, tak těžký řetězec jsou rozděleny do dvou domén: jedna proměnná, schopná rozpoznávat antigen a druhá konstanta nebo konzervovaná, charakteristika každého druhu.

Antigeny jsou funkčně definovány jako molekuly, které mohou být rozpoznávány protilátkou, a z velké části jsou to proteiny. Když je zvíře vystaveno antigenu, aktivují se lymfocyty imunitního systému, čímž se proti němu vytvoří specifické protilátky, které fungují jako obranný systém.

Antigen, jako je například protein, může mít více než jeden epitop nebo místo rozpoznávání protilátkou, takže sérum zvířete vystaveného antigenu může mít polyklonální protilátky proti různým oblastem stejného proteinu.

Imunofluorescence tedy využívá schopnosti zvířete produkovat polyklonální protilátky proti specifickému antigenu, aby jej vyčistila a následně použila pro detekci stejného antigenu v jiných kontextech.

Mezi fluorescenční barviva nebo molekuly nejpoužívanější pro některé imunofluorescenční techniky patří fluorescein isothiokyanát (FITC), tetramethylrhodamin isothiokyanát-5 a 6 (TRITC), mnoho kyaninů jako Cy2, Cy3, Cy5 a Cy7 a barviva zvaná Alexa Fluor®, jako je Alexa Fluor®448.

Protokol

Imunofluorescenční protokol se liší v závislosti na mnoha faktorech, obecně však zahrnuje lineární sled kroků sestávající z:

• Příprava destiček a buněk
• Fixace vzorků
• Permeabilizace
• Blokování
• Imunostainování nebo imunostainování
• Montáž a pozorování

-Příprava

Ze vzorků

Příprava vzorků bude záviset na jejich povaze a typu zkušeností, které mají být provedeny. Nejjednodušší případ, který zahrnuje použití buněk v suspenzi, bude vysvětlen níže.

Buňky v suspenzi, tj. V kapalném kultivačním médiu, musí být nejprve z něj odděleny odstředěním a poté musí být promyty pufrovacím roztokem nebo izosmotickým "pufrem", který udržuje jejich integritu.

Normálně se používá fosfát-slaný pufr známý jako PBS, ve kterém jsou buňky resuspendovány a tato směs je znovu centrifugována, aby se získaly buňky bez kultivačního média, které může obsahovat interferující látky.

Z čepelí

Sklíčka použitá pro mikroskopické pozorování, kde budou buňky později fixovány pro odpovídající následné ošetření, musí být také pečlivě připravena.

Jsou pokryty nebo "senzibilizovány" roztokem poly-lysinu, syntetického polymeru, který bude působit jako "molekulární lepidlo" mezi buňkami a pevným nosičem, díky elektrostatické interakci mezi kladnými náboji jejich aminoskupin a negativní náboje na proteiny, které obalují buňky.

Fixace vzorků

Tento proces spočívá v imobilizaci proteinů, které se nacházejí uvnitř buňky, aby se jejich prostorové umístění neporušilo. Použité molekuly musí být schopné procházet všemi typy buněčných membrán a tvořit mřížky s kovalentními proteiny.

Široce se používá formaldehyd a paraformaldehyd, glutaraldehyd a dokonce i methanol, s nimiž se buněčné vzorky inkubují po určitou dobu a poté se promyjí roztokem izosmotického pufru.

Po fixaci buněk jsou nadále připojeny k fóliím dříve senzibilizovaným poly-lysinem.

Permeabilizace

V závislosti na typu prováděného testu bude nutné permeabilizovat studované buňky nebo ne. Pokud je hledáno znát umístění, přítomnost nebo nepřítomnost určitého proteinu na buněčném povrchu, permeabilizace nebude nutná.

Na druhou stranu, pokud chcete vědět umístění proteinu uvnitř buňky, je nezbytná permeabilizace a bude spočívat v inkubaci vzorků s Triton X-100, detergentem schopným permeabilizovat buněčné membrány.

Blokování

Zásadním krokem ve všech imunologických technikách je blokování. V této fázi postupu blokování spočívá v tom, že na senzibilizovaných listech se pokryjí všechna místa poly-lysinovými molekulami, na které buňky nepřilepily. To znamená, že brání jakémukoli nespecifickému spojení.

K blokování se obvykle používají roztoky s hovězím sérovým albuminem (BSA) v PBS pufru a nejlepší výsledky se získají tím delší inkubační doba s tímto roztokem. Po každém kroku, včetně blokování, je nutné zbývající roztok omýt.

Imunostainování nebo imunostainování

Postup imunofarbení nebo imunofarbení bude záviset hlavně na tom, zda se jedná o přímou nebo nepřímou imunofluorescenci (viz níže).

Pokud se jedná o primární nebo přímou imunofluorescenci, vzorky budou inkubovány s požadovanými protilátkami, které musí být spojeny s fluorescenčními barvivy. Inkubační postup spočívá ve zředění protilátky v roztoku, který bude také obsahovat BSA, ale v nižším poměru.

V případě sekundární nebo nepřímé imunofluorescence by měly být provedeny dvě po sobě jdoucí inkubace. Nejprve s požadovanými protilátkami a poté s protilátkami, které jsou schopné detekovat konstantní oblasti primárních imunoglobulinů. Jsou to tyto sekundární protilátky, které jsou kovalentně vázány na fluorofory.

Tato technika je velmi univerzální a umožňuje současné značení více než jednoho antigenu na vzorek, pokud existují primární protilátky spojené s různými fluorofory, v případě přímé imunofluorescence.

Pro současné značení v nepřímé imunofluorescenci je nutné zajistit, aby každá primární protilátka byla produkována u jiného zvířete, a aby každá sekundární protilátka byla navázána na jiný fluorofor.

Stejně jako blokování poskytuje inkubace s protilátkami lepší výsledky, čím delší je doba. Po každém kroku je nutné odstranit přebytečné protilátky, které se nevázaly na vzorky, a v sekundární imunofluorescenci je nutné před přidáním sekundární protilátky blokovat.

Některé techniky používají jiné skvrny, které nesouvisejí s imunofarbením, jako je barvení jaderné DNA fluoroforem DAPI.

Montáž a pozorování

Během konečné inkubační doby s fluorofory je nutné, aby vzorky zůstaly ve tmě. Pro pozorování pod mikroskopem je běžné používat některé látky k zachování fluorescence fluoroforů spojených s protilátkami.

Typy

Grafické shrnutí přímé a nepřímé imunofluorescence (Zdroj: Westhayl618 via Wikimedia Commons)

Přímá nebo primární imunofluorescence

Souvisí to s detekcí antigenů pomocí fluorescenčních protilátek. Hlavní výhodou použití této techniky je její rychlost, nicméně v procesu může nastat mnoho případů nespecifické vazby, zejména při studiu lidských sér, protože jsou bohaté na vysoce heterogenní protilátky.

Nepřímá nebo sekundární imunofluorescence

To je také známé jako "sendvič" technika, a to zahrnuje vývoj techniky ve dvou krocích. První má co do činění s použitím nefluorescenční protilátky a její vazbou na požadovaný antigen.

Proti konstantní oblasti této první protilátky (která bude nyní sloužit jako antigen) se používá druhá protilátka, která je schopna ji rozeznat, která je spojena s fluorescenční molekulou.

Vzhled fluorescenčního signálu bude výsledkem specifického rozpoznávání mezi první nefluorescenční protilátkou a sledovaným antigenem; přítomnost této první protilátky je podmínkou přítomnosti druhé protilátky, která je značená a díky níž lze určit přítomnost nebo nepřítomnost antigenu.

Přestože je to mnohem časově náročnější technika než přímá imunofluorescence (protože zahrnuje jeden další inkubační krok), tato technika nezahrnuje design fluorescenční protilátky pro každý zkoumaný antigen, což má z ekonomického hlediska za následek životaschopnější.

Dále jde o citlivější techniku, pokud jde o amplifikaci signálu, protože více než jedna sekundární protilátka se může vázat na konstantní oblast primární protilátky, čímž se zesiluje intenzita fluorescenčního signálu.

Aplikace

Jak již bylo uvedeno výše, imunofluorescence je nesmírně všestranná technika, která se v mnoha vědních a klinických oborech používá mnoha způsoby. Může být použit k zodpovězení ekologických, genetických a fyziologických otázek týkajících se mnoha organismů.

Z klinických aplikací se používá pro přímou diagnostiku některých dermatologických onemocnění, a to buď pomocí přímé nebo nepřímé imunofluorescence na epitelové tkáni studovaných pacientů.

Imunofluorescenční techniky byly dostupné v jednobuněčných organismech, jako jsou například kvasinky, pro vizualizaci intranukleárních a cytoplazmatických mikrotubulů, aktinů a asociovaných proteinů, 10nm vláken a dalších složek cytoplazmy, membrány a buněčných stěn.

Reference

1. Abcam, imunocytochemie a imunofluorescenční protokol. Citováno z abcam.com
2. Greph, C. (2012). Fluorescenční barviva. Citováno z leica-microsystems.com
3. Miller, DM, a Shakest, DC (1995). Imunofluorescenční mikroskopie. In Methods in Cell Biology (svazek 48, str. 365–394). Academic Press, Inc.
4. Odell, ID a Cook, D. (2013). Imunofluorescenční techniky. Journal of Investigative Dermatology, 133, 1-4.
5. Princle, BJR, Adams, AEM, Druain, DG, & Brian, K. (1991). Imunofluorescenční metody pro kvasinky. In Methods of Enzymology (svazek 194, str. 565–602). Academic Press, Inc.
6. Schaeffer, M., Orsi, E. V a Widelock, D. (1964). Aplikace imunofluorescence ve virologii veřejného zdraví. Bacteriological Reviews, 28 (4), 402–408.
7. Vrieling, EG, and Anderson, DM (1996). Imunofluorescence ve fytoplanktonovém výzkumu: aplikace a potenciál. J: Phycol., 32, 1-16.