PRŮMĚRNÉ: PŘÍPRAVA, POUŽITÍ A OMEZENÍ - BIOLOGIE - 2025

OF nebo glukózy fermentační médium je polotuhá agar speciálně navržen pro studium oxidačních a fermentační metabolismus sacharidů v významnou skupinou jinými než Enterobacteriaceae mikroorganismy, zvané non-enterosolventní gramnegativní bacily.

Vytvořil jej Hugh a Leifson; tito vědci si uvědomili, že konvenční způsoby studia produkce kyseliny z uhlohydrátů nejsou pro tuto specifickou skupinu bakterií vhodné.

A. Obchodní bazální OF střední. B. Zkumavky s naočkovaným médiem OF. Zdroj: A a B Fotografie pořízené autorem MSc. Marielsa Gil.

Důvodem je, že ne enterosolventní gramnegativní tyčinky obecně produkují malé množství kyselin, na rozdíl od Enterobacteriaceae.

V tomto smyslu má OF médium zvláštní vlastnosti, které mohou detekovat malá množství vytvořené kyseliny, a to jak oxidační, tak fermentační cestou. Tyto rozdíly souvisejí s množstvím peptonů, uhlohydrátů a agaru.

Toto médium obsahuje méně peptonů a vyšší koncentraci uhlohydrátů, čímž se redukují produkty, které alkalizují médium v ​​důsledku metabolismu bílkovin a zvyšuje produkci kyselin v důsledku použití uhlohydrátů.

Na druhé straně, snížení množství agaru podporuje šíření kyseliny produkované v médiu a umožňuje nám pozorovat pohyblivost.

Médium OF se skládá z peptonu, chloridu sodného, ​​bromtymolové modři, fosforečnanu draselného, ​​agaru a uhlohydrátu. Nejčastějším uhlohydrátem je glukóza, ale lze použít i jiné látky, podle kterých se člověk chce studovat, mezi jinými například laktóza, maltóza, xylóza.

Základ

Jako každé kultivační médium musí OF médium obsahovat výživné látky, které zaručují bakteriální růst; tyto látky jsou peptony.

Uhlovodík poskytuje energii a současně slouží ke studiu chování mikroorganismu proti němu, to znamená, že umožňuje, aby byly bakterie klasifikovány jako oxidační, fermentační nebo nesacharolytický organismus.

Médium OF obsahuje poměr pepton / uhlohydrát 1: 5 na rozdíl od konvenčního média 2: 1. Tím je zajištěno, že množství alkalických aminů vznikajících při degradaci peptonů nezneutralizuje tvorbu slabých kyselin.

Na druhé straně médium obsahuje chlorid sodný a fosforečnan draselný. Tyto sloučeniny osmoticky stabilizují médium a regulují pH. Bromothymolová modrá je indikátor pH, který mění barvu média ze zelené na žlutou s produkcí kyseliny.

Některé mikroorganismy mohou používat uhlohydráty oxidační nebo fermentační cestou, zatímco jiné neberou žádnou cestu.

To závisí na vlastnostech každého mikroorganismu. Například některé přísné aerobní mikroorganismy mohou oxidovat určité uhlohydráty a fakultativní anaeroby mohou oxidovat a fermentovat v závislosti na okolním prostředí, zatímco jiné neoxidují ani fermentují uhlohydráty (asakarolytické).

Nakonec existuje modifikace OF média doporučeného CDC, která obsahuje speciální OF bázi s fenolickou červenou jako indikátorem.

Oxidační proces

Proces oxidace glukózy nevyžaduje fosforylaci glukózy, stejně jako proces fermentace. V tomto případě se aldehydová skupina oxiduje na karboxylovou skupinu, což vede k kyselině glukonové. To se zase oxiduje na 2-ketoglukonovou kyselinu.

Ten se buď hromadí nebo štěpí na dvě molekuly kyseliny pyruvové. Tento systém vyžaduje přítomnost kyslíku nebo nějaké anorganické sloučeniny jako konečného akceptoru elektronů.

Produkce kyselin touto cestou je slabší než produkce získaná fermentační cestou.

Fermentační proces

Aby k fermentaci glukózy došlo jakoukoli z dostupných cest, musí být nejprve fosforylována a stát se glukózou-6-fosfátem.

Kvašení glukózy může probíhat několika cestami, z nichž hlavní je trasa Embden-Meyerhof-Parnas, ale také trasa Entner-Doudoroff nebo trasa hexosychosforečnanu Warburg-Dickens, také známá jako degradace pentóz.

Zvolená cesta bude záviset na enzymatickém systému, který mikroorganismus vlastní.

Přes Embden-Meyerhof- Parnas

Při fermentaci glukózy cestou Embden-Meyerhof-Parnas se štěpí na dvě triosové molekuly, které se později rozloží na různé sloučeniny uhlíku, až do vzniku glyceraldehyd-3-fosfátu. Odtud vznikne meziprodukt, kterým je kyselina pyruvová.

Odtud se vytvoří různé typy směsných kyselin, které se mohou lišit od jednoho druhu k druhému.

Tento systém se vyskytuje v nepřítomnosti kyslíku a vyžaduje jako konečný elektronový akceptor organickou sloučeninu.

Cesta Entner-Doudoroff

Při fermentaci glukózy cestou Entner-Doudoroff se glukóza 6-fosfát stává glukono-ᵼ-lakton-6-fosfátem a odtud se oxiduje na 6-fosfoglukonát a 2-keto-3-deoxy-6-. fosfoglukonát, aby se nakonec vytvořila kyselina pyruvová. Tato cesta potřebuje kyslík, aby došlo k glykolýze.

Dráha degradace pentóz nebo monofosfátová cesta Warburg-Dickens Hexoxa

Tato cesta je hybridem výše uvedeného 2. Začíná podobně jako Entner-Doudoroffova cesta, ale později se tvoří glyceraldehyd-3-fosfát jako prekurzor kyseliny pyruvové, jak se vyskytuje v Embden-Meyerhof-Parnasově dráze.

Příprava

Vážit:

2 g peptonu

5 g chloridu sodného

10 g D-glukózy (nebo připravovaného uhlohydrátu)

0,03 g bromtymolové modři

3 g agaru

0,30 g fosforečnanu draselného

1 litr destilované vody.

Smíchejte všechny sloučeniny kromě uhlohydrátů a rozpusťte v 1 litru destilované vody. Zahřejte a protřepávejte, dokud se úplně nerozpustí.

Po ochlazení na 50 ° C se přidá 100 ml 10% glukózy (filtrované).

Asepticky rozdělte 5 ml média OF do zkumavek s vatovým uzávěrem a autoklávujte při tlaku 121 ° C, tlaku 15 liber po dobu 15 minut.

Nechejte ztuhnout ve svislé poloze.

PH média by mělo být 7,1. Barva připraveného média je zelená.

Uchovávejte v chladničce.

Aplikace

Médium OF je speciální médium pro stanovení metabolického chování mikroorganismu vůči uhlohydrátům. Obzvláště pro ty, které tvoří malé, slabé nebo žádné kyseliny.

Zaseté

Pro každý mikroorganismus jsou zapotřebí 2 zkumavky, obě musí být naočkovány zkoumaným mikroorganismem. Kolonie je odebrána s přímou rukojetí a propíchnutí je provedeno ve středu zkumavky bez dosažení dna; Lze provést několik vpichů, pokud není zájem o pozorování pohyblivosti.

Do jedné zkumavek se přidá vrstva sterilního tekutého vazelíny nebo sterilního roztaveného parafinu (přibližně 1 až 2 ml) a označí se písmenem "F". Druhá trubice je ponechána původní a označená „O“. Obě zkumavky se inkubují při 35 ° C a pozorují se denně až 3 až 4 dny.

Výklad

Metabolismus a produkce plynu

Tabulka: Klasifikace mikroorganismů podle jejich chování v otevřených (oxidačních) a uzavřených (fermentačních) zkumavkách

Zdroj: Autor autor MSc. Marielsa gil

Plyn je pozorován za vzniku bublin nebo přemístění agaru.

Je třeba poznamenat, že organismus, který pouze oxiduje glukózu, ale nefermentuje ji, nebude schopen fermentovat jiné uhlohydráty, v každém případě ji pouze oxiduje. Proto bude v této situaci utěsněna zkumavka pro studium dalších uhlohydrátů.

Pohyblivost

Kromě toho lze vidět pohyblivost v OF médiu.

Pozitivní pohyblivost: růst, který není omezen na oblast očkování. Tam je růst ke stranám trubice.

Negativní pohyblivost: růst pouze v počátečním inokulu.

QA

Jako kontroly kvality lze použít následující kmeny: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa a Moraxella sp. Očekávané výsledky jsou:

1. coli: fermentor glukózy (žluté i šumivé zkumavky).
2. aeruginosa: Okysličovadlo glukózy (otevřená žlutá zkumavka a zelené nebo modré těsnění).
3. Moraxella sp: Není sacharolytická (zelená nebo modrá otevřená zkumavka, zelená uzavřená zkumavka).

Omezení

- Některé mikroorganismy nemohou růst v OF médiu. V těchto případech se zkouška opakuje, ale do média se přidá 2% sérum nebo 0,1% kvasnicový extrakt.

- Oxidační reakce jsou často pozorovány pouze blízko povrchu a zbytek média může zůstat zelený, stejným způsobem je považován za pozitivní.

Reference

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey a Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
3. Mac Faddin J. (2003). Biochemické testy pro identifikaci bakterií klinického významu. 3. ed. Editorial Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
4. Francisco Soria Melguizo Laboratories. 2009. Glukózového média. K dispozici na adrese:
5. Conda Pronadisa Laboratories. OF glukózového média. K dispozici na adrese: condalab.com
6. Laboratoře BD. 2007. OF Basal Medium. K dispozici na adrese: bd.com