KULTURNÍ MÉDIA: HISTORIE, FUNKCE, TYPY, PŘÍPRAVA - BIOLOGIE - 2025

Tyto kultivační média jsou speciální výživové přípravky pro obnovu, izolace a udržování bakteriálních a houbových mikroorganismů. Tato média mohou být pevná, kapalná nebo polotuhá.

Louis Pasteur byl první, kdo ukázal, že ve vývaru vyrobeném z vařených kousků masa se bakterie využívaly k reprodukci ve velkém počtu až do okamžiku, kdy se vývar zahalil. V tomto smyslu je masový vývar Pasteur považován za první použité kapalné kultivační médium.

Surová a připravená kultivační média (pevná a kapalná). Zdroj: Flickr

Poté Robert Koch s pomocí svých spolupracovníků Julius Richard Petri a Walter Hesse udělali velký pokrok. První navržený Petriho pokrm, který se dodnes používá; a druhý došlo k němu, že nahradil želatinu za agar-agar, aby připravil pevná kultivační média, což bylo velmi důležité, protože želatina byla degradována některými mikroorganismy.

V současné době existuje mnoho tříd kultivačních médií s různými účely, proto jsou klasifikována podle jejich funkce: mezi nejdůležitější můžeme zmínit nutriční, selektivní, diferenciální, transportní, obohacující a počítající kultivační média. kolonie, údržba a testování citlivosti.

Některá kultivační média jsou speciální pro pozorování chemických reakcí a jsou velmi užitečná pro identifikaci daného mikroorganismu. Mezi nimi můžeme zmínit: Kliglerovo médium, MIO, LIA, citrát a další.

Dějiny

První kultivační médium připravil Louis Pasteur, když se pokusil ukázat, že mikrobiální život není produktem spontánní generace, ale že mikroorganismy se mohou množit a také že pocházejí ze vzduchu.

Připravil vývar s kousky masa a pozoroval, že po několika dnech po vystavení vzduchu se zakalil a ve vývaru bylo značné množství mikroorganismů. Současně další vývar s dříve vařenými a hermeticky uzavřenými kousky masa zůstal průsvitný, jak dny ubíhaly.

To upoutalo pozornost mnoha vědců a uvědomili si, že tyto mikroorganismy jsou zodpovědné za rozklad masa a za způsobení některých nemocí.

Z tohoto důvodu bylo nezbytné vytvořit způsob, jak tyto mikroorganismy reprodukovat v laboratoři, aby bylo možné je dále zkoumat.

V tomto smyslu Robert Koch neocenitelně přispěl ke zlepšení některých laboratorních technik, zejména těch, které se týkají izolace bakterií, když představil koncept pevného kultivačního média.

Nejprve použil bramborové plátky jako pevné médium, ale později přidal do masových vývarů želatinu s lepšími výsledky. Byly však časy, kdy se želé roztaví a promění se v tekutou kulturu. Dnes je známo, že k tomu dochází, protože některé bakterie jsou schopné hydrolyzovat želatinu.

Tehdy jeden z jeho spolupracovníků přišel s myšlenkou používat agar-agar, směs, kterou jeho žena používala zahušťovat své sladkosti.

Toto základní kultivační médium se postupně stává sofistikovanějším, až dosáhne kultivačního média, které je dnes známé.

Složení

Každé médium má jiné složení, ale je nezbytné, aby obsahovalo specifické živiny pro dobrý vývoj typu požadovaného mikroorganismu.

Může také obsahovat specifické chemické látky, které pomáhají odhalit metabolickou dráhu, kterou má určitý kmen, nebo které vykazují přítomnost určitých enzymů.

Dalším důležitým prvkem je použití tlumivých látek. Pomáhají udržovat osmotickou rovnováhu média i pH.

Mohou také obsahovat uhlohydráty a indikátor pH, který ukazuje fermentaci přidaného cukru. Pokud dojde k okyselení způsobenému fermentací, bude pozorována změna barvy média.

Některá kultivační média obsahují inhibiční látky. V závislosti na použité látce bude růst některých mikroorganismů omezen a u jiných bude upřednostňován.

Druhy kultivačních médií

Kultivační média jsou tříděna podle různých kritérií. Jsou to: podle jeho konzistence, složení a funkce.

- Podle jeho konzistence

Kapaliny

Neobsahují agar-agar. Bakteriální nebo houbový růst je doložen zákalem vývaru, který je původně průsvitný.

Pevný

Obsahují 1,5 až 2% agar-agar. Ztuhlá směs má povrch, který odolává jemnému pohybu držadla platiny, aniž by jej rozbila.

Polotuhý

Obsahují přibližně 0,5% agar-agar, jedná se tedy o přechodný stav mezi kapalinou a pevnou látkou. Ideální pro média, která slouží k vidění pohyblivosti. Doporučují se také pro zachování kmenů, protože udržují vlhkost mnohem déle.

Bifázický

Jsou to média, která jsou připravena takovým způsobem, že existuje pevná fáze a na ní kapalné médium. Široce se používá pro krevní kultury.

- Podle svého složení

Přírodní pěstební média

Jsou to látky, které se přímo pěstují z přírody, aby kultivovaly bakterie a poskytovaly jim prostředí tak blízké tomu, jak se normálně vyvíjejí v ekosystému. Příklad, mléko, džusy, zředěná krev, sérum atd.

Syntetická kultivační média

Dnes jsou nejpoužívanější, jsou to dehydratovaná média, která získáváme v komerčních domech a která jsou známá svým chemickým složením, protože byla strategicky navržena podle typu izolovaného mikroorganismu.

Polosyntetická kultivační média

Jedná se o kombinaci syntetického média, do kterého se přidává přírodní prvek, který obohacuje médium.

Médium buněčné kultury

Jsou to speciální média pro pěstování virů, protože tyto mikroorganismy nejsou schopny přežít mimo buňky, musí obsahovat tkáň nebo živé buňky ze zvířete nebo rostliny.

Příklad: opičí ledvinové buněčné kultury nebo embryonovaná vejce.

- Podle jeho užitečnosti

Nutriční, selektivní, diferenciální, transportní, obohacovací, identifikační, kvantifikace kolonií, udržovací a susceptibilní testovací média. Budou popsány později.

Funkce

Bez ohledu na typ kultivačního média mají všichni něco společného a to znamená, že usnadňují nebo podporují reprodukci určitých mikroorganismů. Rozdíl spočívá ve složení každé z nich, což je určujícím faktorem pro konečnou užitečnost, kterou budou mít.

Každé ze stávajících kulturních médií je strategicky navrženo pro konkrétní funkci, pro kterou bylo vytvořeno, to znamená, že všichni mají nadaci, která řídí pokyny pro jejich konkrétní funkci.

Je třeba poznamenat, že kultivační médium po vysetí musí být vystaveno teplotním a kyslíkovým podmínkám odpovídajícím typu bakterií nebo hub, které mají být izolovány.

Například, pokud chcete izolovat mesofilní anaerobní bakterie, můžete použít krevní agar a inkubovat za anaerobních podmínek (bez kyslíku) při 37 ° C po dobu 48 hodin.

Nyní, pokud je třeba houbu izolovat, použije se agar Sabouraud s antibiotiky. Inkubuje se v aerobióze při pokojové teplotě po dobu několika dnů, protože ty pomalu rostou.

Výživná prostá kultivační média

Jak již název napovídá, tato kultivační média obsahují výživné látky, jako jsou zdroje vitamínů, aminokyseliny, dusík a uhlík, mezi nimiž lze zmínit: masový extrakt nebo kvasnicový extrakt, kukuřičný škrob, pankreatický trávník, peptony, glukóza, mezi ostatními.

Obsahují také další složky, které poskytují prostředí osmotickou rovnováhu, protože většina plodin vyžaduje pH blízké 7,0. Těmito prvky mohou být mimo jiné: chlorid sodný, fosforečnan disodný.

Ředidlo je destilovaná voda a pevná média mají agar-agar.

Účelem těchto kultivačních médií je získat bakteriální nebo fungální mikrobiotu, která existuje v daném vzorku. Nerozlišuje mezi mikroorganismy, protože je schopna pěstovat velké množství bakterií, grampozitivních i gramnegativních, jakož i kvasinek a myceliálních hub.

Doporučují se pro očkování vzorků z normálně sterilních míst. Nejsou však vhodné pro náročné mikroorganismy.

Jsou také užitečné pro udržování kmenů, pokud neobsahují glukózu.

Obohacená kultivační média

Pokud se do jednoduchých živných médií přidá krev nebo zahřátá krev, stanou se obohacenými médii (krevní agar a čokoládový agar).

Tato média jsou velmi užitečná pro očkování normálně sterilních vzorků, pro záchranu slabých kmenů a pro izolaci nutričně náročných mikroorganismů.

Selektivní kultivační média

Selektivní kultivační média kromě toho, že obsahují důležité živiny pro růst určitých požadovaných mikroorganismů, se přidávají také inhibiční látky, jako jsou například antibiotika, antimykotika, barviva, žlučové soli.

Inhibiční látky jsou určeny ke snížení rozmanitosti kmenů, které mohou růst, ve prospěch růstu zvláště zvláštní skupiny, která má být zachráněna.

Příklad: EC vývar (speciální pro celkové a fekální koliformní formy) nebo agar Sabouraud s antibiotiky (specifický pro houby).

Diferenční kultivační média

Diferenciální média obsahují nutriční prvky nezbytné pro růst určité skupiny mikroorganismů a také obsahují látky, které budou v přítomnosti určitých mikroorganismů metabolizovány nebo degradovány.

To znamená, že budou vyvolávat chemické reakce, které se tak či onak projeví v kultivačním médiu.

Některé reakce médium alkalizují nebo okyselují a díky přítomnosti indikátoru pH lze tyto změny prokázat barevným posunem v médiu a v kolonii.

Proto mezi velkou skupinu bakterií, které budou schopny růst v tomto médiu, budou rozlišeny ty, které metabolizují nebo degradují látku, a ty, které se jednoduše nerozlišují pozorováním barvy kolonie a média.

Například krevní agar umožňuje odlišit bakterie, které způsobují beta hemolýzu (jasný halo), od bakterií, které způsobují alfa hemolýzu (nazelenalý halo), a ty, které neprodukují hemolýzu.

Selektivní a diferenciální média

Příkladem toho je to, co se děje na agaru MacConkey. Je selektivní, protože umožňuje pouze růst gramnegativních bacilů; a je odlišný, protože bakterie fermentující laktózu (kolonie fuchsie) lze odlišit od nekvasících bakterií (světle růžové nebo bezbarvé).

Transportní kultivační média

Jak napovídá jejich název, jedná se o prostředky používané k přepravě vzorků, které byly odebrány na více či méně vzdáleném místě, do laboratoře, která bude vzorek zpracovávat. Transportní médium udržuje vzorek v nejlepších podmínkách, takže se získají spolehlivé výsledky.

Tato kultivační média mají velmi zvláštní vlastnosti, protože nemohou být překročeny v živinách, protože bakteriální populace, která je přítomna, musí zůstat životaschopná, ale bez zvýšení počtu.

Jsou to obvykle polotuhá média, která umožňují vzorku zůstat hydratovaný. Nemělo by však dojít k žádnému kompromisu při získávání vzorku do laboratoře co nejdříve. Příklady dopravních prostředků: Stuart medium, Cary Blair a Amies.

Obohatit kultivační média

Tato kultivační média jsou kapalná. Používají se k záchraně specifických patogenů, které mohou být v daném okamžiku přítomny ve vzorku v minimálním množství.

Je také užitečné zachránit patogenní kmen, který může být slabý z předchozí léčby. Příklad: peptonová voda, thioglykolátový vývar a selenitový vývar.

Tato média mají inhibiční látky, které brání růstu doprovodné mikrobioty, a specifické živiny, které podporují vývoj sledovaných mikroorganismů.

Kultivační média pro identifikační účely

Tato média obsahují látky, které mohou být chemicky metabolizovány určitými bakteriemi, a vyvolávají chemické reakce, které ukazují přítomnost specifických enzymů nebo metabolických drah.

Používají se proto jako biochemické testy, které napomáhají rozpoznání rodu a druhu konkrétní skupiny kmenů. Příklad: Kliglerovo médium ukazuje, zda je mikroorganismus schopen fermentovat glukózu a laktózu, pokud produkuje sirovodík a plyn.

Toto médium obsahuje odhalující látky, které umožňují pozorování reakce, jako je indikátor pH, a ionty železa.

Tento jednoduchý test může odlišit dvě velké skupiny bakteriálních mikroorganismů, jako jsou bakterie patřící do rodiny Enterobacteriaceae, od tzv. Nekvasících bakterií.

Média pro počítání kolonií

Jedná se o jednoduchá neselektivní média, která slouží ke kvantifikaci mikrobiální populace, jako je standardní médium pro počítání. Typ mikroorganismu, který bude růst v tomto médiu, bude záviset na teplotních a kyslíkových podmínkách, které jsou stanoveny.

Kultivační média pro testování citlivosti

Standardizovaným médiem pro tento účel je Müeller Hintonův agar, toto médium je ideální pro hodnocení chování různých antibiotik proti izolovanému patogennímu mikroorganismu.

Je zvláště užitečný u nenáročných bakterií, zatímco u náročných bakterií je možné jej použít pouze v případě, že je doplněn krví.

Kultivační média pro údržbu

Účelem těchto prostředků je reprodukovat mikroorganismus a také udržovat životaschopnost bakterií nebo hub co nejdéle a také zachovat jeho fyziologické funkce.

Důležitou charakteristikou je, že tento typ média by neměl obsahovat glukózu, protože ačkoli je to prvek, který zajišťuje rychlý růst, jeho fermentace také produkuje kyseliny, které snižují životnost mikroorganismu.

Některé laboratoře musí udržovat životaschopnost některých mikroorganismů pro pozdější použití ve výzkumných studiích, interních kontrolách nebo pro účely vzdělávání.

Příprava

V současné době existuje mnoho komerčních značek, které distribuují různá kultivační média. Médium přichází v lyofilizované nebo dehydrované formě, ve vzduchotěsných nádobách a chráněno před světlem.

Každé médium je opatřeno štítkem s uvedením názvu média, jeho složek, čísla šarže a hmotnosti, kterou je třeba připravit na litr kultivačního média.

Jako ředidlo se používá destilovaná voda. Navážené množství se rozpustí v jednom litru destilované vody, dokud se směs homogenizuje. Většina médií je autoklávována při tlaku 15 liber při teplotě 121 ° C po dobu 15 minut.

Kapalná média jsou autoklávována již distribuována v příslušných pracovních zkumavkách, zatímco pevná média jsou autoklávována v Erlenmeyerových bankách.

Ty se nechají stát, dokud nedosáhnou teploty 55 ° C, a jsou podávány v Petriho miskách uvnitř laminárního digestoru nebo poblíž Bunsenova hořáku. Jsou ponechány ztuhnout a uloženy v lednici vzhůru nohama.

Existují také pevná kultivační média, která jsou distribuována ve zkumavkách, což jim umožňuje ztuhnout buď v čepech (rovný) nebo v zobáku s flétnou (nakloněný).

Před použitím jakéhokoli připraveného kultivačního média, ať už pevného nebo kapalného, ​​musí být před zasetím vzorku temperováno.

Důležitost

Kultivační média jsou nepochybně velmi cenným pracovním nástrojem pro mikrobiology, protože umožňují získat infekční agens, který v určitém okamžiku může ovlivňovat jedince nebo kontaminovat potravu, životní prostředí nebo povrch.

V tomto smyslu lze říci, že mikrobiologie má různá pole, mezi něž patří klinická, průmyslová, environmentální, potravinářská mikrobiologie a ve všech se používají kultivační média.

Typ použitého média se samozřejmě může lišit podle potřeb a typu zpracovaného vzorku. Skupina mikroorganismů hledala také vlivy.

Izolace patogenního mikroorganismu nebo příčina jakékoli kontaminace je nezbytná, aby bylo možné provádět účinnou léčbu nebo přijímat postupy, které pomáhají eliminovat dotyčnou kontaminující látku.

V případě klinické mikrobiologie není důležité pouze izolovat mikroorganismus a identifikovat ho (znát rod a druh), ale musí být proveden také antibiogram.

Tato studie, která také používá kultivační médium, nám umožní říci, které antimikrobiální látky jsou citlivé a které jsou rezistentní nebo zkráceně, které mohou být použity jako léčba a které nemohou.

Proto v mikrobiologické laboratoři, ať už je oblast jakákoli, kultivační média obecně nemohou chybět.

Konečně lze říci, že kultivační médium umožnilo zkoumat různé aspekty bakterií i hub.

Kontrola kvality kultivačních médií

Příprava a použití kultivačních médií by se nemělo provádět lehce. V každé laboratoři musí být oddělení, které aplikuje protokoly kontroly kvality na médium, pokaždé, když jsou připraveny nové šarže, a tak zajistit, aby byly řádně připraveny, sterilní a funkční.

K posouzení jejich sterility se z každé šarže náhodně odebere jedno nebo dvě média a inkubují se při 37 ° C po dobu několika dnů (nemělo by docházet k růstu). K ověření jejich funkce se používají řádně kultivované a životaschopné referenční kmeny ATCC (American Type Culture Collection).

Likvidace kultivačních médií

Po použití kultivačního média musí být médium zlikvidováno tak, aby neznečišťovalo životní prostředí.

Z tohoto důvodu je materiál před likvidací sterilizován v autoklávu. Následně se materiál odstraní ze skleněného nádobí. Ten se pak promyje, suší, sterilizuje a skladuje pro pozdější použití. V případě použití jednorázových desek se tyto sterilizují a později vyhodí do speciálních sáčků.

Reference

1. Mikrobiologie Borrego v známkách VIII. Robert Koch: Triumf vytrvalosti (I). News SEM 2018, 117 (1): 1-18 University of Malaga. K dispozici na adrese: jornades.uab.cat/
2. Volcy C. Geneze a vývoj Kochových postulátů a jejich vztah k fytopatologii. Recenze v Kolumbii. 2008; 26 (1): 107-115. K dispozici na adrese: scielo.org.co/
3. Burguetské jezero Nancy, hrad Abraham Lourdes. Kontrola kvality kultivačních médií používaných při monitorování životního prostředí klasifikovaných produkčních oblastí. Rev Cubana Hig Epidemiol 2013; 51 (2): 155 - 160. K dispozici v: scielo.
4. Bonilla M, Pajares S, Vigueras J, Sigala J, Le Borgne S. Didaktický materiální manuál základních mikrobiologických postupů. Metropolitní autonomní univerzita. Oddělení přírodních věd a techniky. Cuajimalpa Unit. 2016. K dispozici na adrese: cua.uam.mx/
5. Carbajal A. Média pro buněčnou kulturu: přehled. Labome Svět laboratoří. University of Pittsburgh Medical Center, Spojené státy americké. 2013 k dispozici v: es /
6. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
7. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey a Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.