BARVENÍ SPÓR: ZDŮVODNĚNÍ, TECHNIKY A POUŽITÍ - BIOLOGIE - 2025

Barvení spór je metoda použitá ke změně barvy na odolnost vůči struktury, které tvoří určitý bakteriální rody, když v nepříznivých podmínkách; Tyto struktury odpovídají formě přežití.

Existuje mnoho rodů, které tvoří spory; hlavní však jsou Bacillus a Clostridium. Tato rody jsou považována za důležitější, protože mají pro člověka patogenní druhy.

Barvení spór metodou Shaeffer - Fulton nebo Wirtz-Conklin. A tambe (původní uploader) z Wikimedia Commons

Každý bacil může vést ke sporům. V době obarvení přípravku se spora nachází uvnitř bacilu (endospore) nebo mimo něj (exospore). U konvenčních technik barvení bakterií - jako je Gramovo barvení - zůstávají spory bezbarvé.

V současné době existuje několik metodik barvení, které jsou schopny proniknout silnou strukturou spór a barvit ji. Tyto metodiky jsou velmi rozmanité; Patří mezi ně Dornerova technika, Möellerova skvrna a metodologie Shaeffera - Fultona, také známá jako Wirtz-Conklin.

Ze všech zmíněných technik je metodika Shaeffer-Fulton nejpoužívanější v rutinních laboratořích. Je pojmenován po dvou mikrobiologech, kteří vytvořili zbarvení v roce 1930: Alicia Shaeffer a MacDonald Fulton. Tato technika se však někdy nazývá Wirtz-Conklin po dvou bakteriologech z 20. let 20. století.

Základ

Spóry nezbarvují konvenčními skvrnami, protože mají velmi silnou zeď. Komplexní složení spór brání vstupu většiny barviv.

Pokud je spór studován zvenčí dovnitř, jsou pozorovány následující vrstvy: nejprve je exosporium, což je nejtenčí a vnější vrstva tvořená glykoproteiny.

Dále přichází kutikula, která poskytuje odolnost vůči vysokým teplotám, následovaná kůra složená z peptidoglykanu. Později je stěna základny, která chrání protoplast.

Spór je dehydratovaná struktura, která obsahuje 15% vápníku a kyseliny dipikolinové. Proto většina technik barvení spór závisí na aplikaci tepla, takže barvivo může proniknout silnou strukturou.

Jakmile je spora zbarvená, nemůže barvivo odstranit. Při technice Shaeffer - Fulton vstupuje malachitová zeleň do vegetativních buněk a při působení tepla proniká do endospor i exospor.

Promytím vodou se barvivo odstraní z vegetativní buňky. K tomu dochází, protože malachitové zelené barvivo je mírně základní, takže se slabě váže na vegetativní buňku.

Místo toho se nemůže dostat ze spor a nakonec je bacil kontrastně barven safraninem. Tato nadace platí pro zbytek technik, ve kterých se něco podobného děje.

Techniky barvení spór

Aby se provedlo barvení spór, musí se získat čistá kultura podezřelého kmene, který má být studován.

Kultura je vystavena extrémním teplotám po dobu 24 hodin, aby stimulovala mikroorganismus ke sporulaci. Za tímto účelem může být kultura umístěna v peci při 44 ° C nebo v lednici (8 ° C) na 24 nebo 48 hodin.

Pokud zůstane při uvedených teplotách příliš dlouho, budou pozorovány pouze exospory, protože všechny endospory již opustily bacil.

Na konci této doby se na čisté sklíčko umístí několik kapek sterilního fyziologického roztoku. Poté se odebere malá část kultury a provede se jemné rozprostření.

Poté se nechá uschnout, zafixuje se v žáru a obarví se jednou z technik vysvětlených níže:

Dornerova technika

1 - Připravte ve zkumavce koncentrovanou suspenzi sporovaného mikroorganismu v destilované vodě a přidejte stejný objem filtrovaného fuchsinu Kinyoun karbol.

2 - Zkumavku vložte do lázně s vroucí vodou po dobu 5 až 10 minut.

3 - Na čistém sklíčku smíchejte kapku předchozí suspenze s kapkou 10% vodného roztoku nigrosinu, vařte a filtrujte.

4 - Rozetřete a rychle usušte jemným teplem.

5. Zkoušejte objektivem 100X (ponoření).

Spóry zbarví červeně a bakteriální buňky se na tmavě šedém pozadí zdají téměř bezbarvé.

Modifikovaná Dornerova technika

1 - Suspenze sporulovaného mikroorganismu je rozprostřena na sklíčku a fixována v žáru.

2- Vzorek se přikryje pásem filtračního papíru, ke kterému se přidá karbol fuchsin. Barvivo se zahřívá 5 až 7 minut plamenem Bunsenova hořáku, dokud se nevytvoří výpary. Poté je papír odstraněn.

3 - Přípravek se promyje vodou a poté se vysuší savým papírem.

4. Nátěr zakryjte tenkým filmem 10% nigrosinu, pomocí druhého sklíčka rozprostřete nigrosin nebo jehlu.

Zbarvení spór a bakterií je stejné jako u předchozího stavu techniky.

Shaeffer - technika Fulton nebo Wirtz-Conklin

1 - Proveďte jemný nátěr se suspenzí sporulovaného mikroorganismu na sklíčku a fixujte na teplo.

2 Sklíčko zakryjte 5% malachitově zeleným vodným roztokem (na sklíčko můžete položit filtrační papír).

3 - Zahřejte plamen Bunsenova hořáku, aby došlo k uvolnění výparů a plamen odstraňte. Opakujte operaci po dobu 6 až 10 minut. Pokud se malachitový zelený roztok během postupu příliš vypaří, lze přidat další.

4 Vyjměte filtrační papír (pokud je nainstalován) a omyjte jej vodou.

5- Sklíčko zakryjte 0,5% vodným safraninem po dobu 30 sekund (některé varianty techniky používají 0,1% vodný safranin a nechte jej 3 minuty).

S touto technikou se spory zdají zelené a bacily červené.

Nevýhodou je, že endospory mladých kultur se nešpiní dobře, protože se jeví jako velmi čiré nebo bezbarvé. Aby se tomu zabránilo, doporučuje se používat kultury po dobu 48 hodin inkubace.

Möellerova technika

1 Potěr zakryjte chloroformem po dobu 2 minut.

2. Zlikvidujte chloroform.

3. Zakryjte 5% kyselinou chromovou po dobu 5 minut.

4. Promyjte destilovanou vodou

5- Deska je pokryta karbolem fuchsin-fenicada a je vystavena plameni Bunsenova hořáku až do emise par; pak je na chvíli odstraněn z plamene. Operace se opakuje do dokončení 10 minut.

6- Opláchněte vodou.

7 - Ke změně barvy použijte okyselený ethanol (chlorovodíkový alkohol). Ponechá se 20 nebo 30 sekund.

8- Omyjte destilovanou vodou.

9 - Kontrastinujte potažením fólie methylenovou modří po dobu 5 minut.

10- Promyjte destilovanou vodou.

11- Nechte uschnout a vzorek se odebere do mikroskopu.

Spóry jsou červené a bacily modré. Je důležité nevdechovat páry, protože jsou toxické a z dlouhodobého hlediska mohou být karcinogenní.

Modifikovaná Möellerova technika bez tepla

V roce 2007 vytvořil Hayama a jeho spolupracovníci modifikaci Möellerovy techniky. Odstranili krok zahřívání barviva a nahradili ho přidáním 2 kapek povrchově aktivní látky Tergitol 7 na každých 10 ml roztoku fuchsin-karbol karbolu. Byly získány stejné výsledky.

Aplikace

Zbarvení spór poskytuje velmi cenné a užitečné informace pro identifikaci patogenu, protože jeho přítomnost, jeho tvar, umístění v bacilu a schopnost deformovat vegetativní buňku či nikoliv jsou údaje, které mohou druh vést zapojený do určitého žánru.

V této souvislosti je třeba říci, že spory mohou být kulaté nebo oválné, mohou být umístěny ve středu nebo také v paracentrální, subminální nebo terminální poloze.

Schéma tvaru a polohy endospor a exospor

Příklady

- Clostridium difficile tvoří oválnou spóru v terminální poloze, která deformuje bacil.

- Spór klostridia terium je oválný, nedeformuje bacil a je umístěn na úrovni terminálu.

- Endospora Clostridium tetani je terminální a deformuje bacil, což dává vzhled paličky.

- Spóry Clostridium botulinum, C. histolyticum, C. novy a C. septicum jsou kulaté nebo subterminální ovály a deformují bacil.

- Endopora Clostridium sordelli se nachází ve střední poloze s mírnou deformací.

Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. (5. vydání). Argentina, Editorial Panamericana SA

Reference

1. Hayama M, Oana K, Kozakai T, Umeda S, Fujimoto J, Ota H, Kawakami Y. Návrh zjednodušené techniky pro barvení bakteriálních spór bez použití tepla - úspěšná modifikace Moellerovy metody. Eur J Med Res. 2007; 16 12 (8): 356-9.
2. Přispěvatelé Wikipedie. Moeller skvrna. Wikipedia, encyklopedie zdarma. 3. listopadu 2018, 03:28 UTC. K dispozici na adrese: en.wikipedia.org
3. Pérez R, Juárez M, Rodríguez (2011). Laboratoř pro mikrobiologické techniky. Katedra mikrobiologie základních věd AV ČR. Národní polytechnický institut.
4. "Endospore." Wikipedia, encyklopedie zdarma. 25. února 2018, 10:20 UTC. 10. ledna 2019, 02:42: en.wikipedia.org
5. Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macías J a spolupracovníci. (2006). Pracovní personál autonomního společenství Extremadura. Specifická agenda Svazek IV. Redakční MAD. Seville-Španělsko, str. 211-212.
6. Silva M., García M., Corrales J., Ponce E. (2006). Odborný laboratorní technik, Galician Health Service (SERGAS). Specifický předmět agendy 2. Redakční MAD. Seville-Španělsko, str. 79-80.
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. (5. vydání). Argentina, Editorial Panamericana SA
8. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Argentina. Editorial Panamericana SA