GIEMSA SKVRNA: ZDŮVODNĚNÍ, MATERIÁLY, TECHNIKA A POUŽITÍ - BIOLOGIE - 2025

Giemsa skvrna je typ barvení klinických vzorků, vztaženo na směs kyselých a zásaditých barviv. Jeho tvorba byla inspirována prací Romanowského, kde ji Gustav Giemsa, chemik a bakteriolog původem z Německa, zdokonalil přidáním glycerolu ke stabilizaci sloučenin.

Změny generované původní Romanowskou technikou umožnily výrazně zlepšit mikroskopická pozorování, proto byla tato technika pokřtěna názvem Giemsa Stain.

Různé vzorky obarvené barvením Giemsa. A. Trypanosoma evansi v periferní krvi. B. Normální krvinky. C. Borrelia theileri v periferní krvi. D. Burkittův lymfom.

Protože se jedná o jednoduchou techniku, vysoce funkční a ekonomickou, v současné době se v klinické laboratoři široce používá pro hematologické nátěry, vzorky kostní dřeně a tkáňové řezy.

Technika barvení Giemsa je velmi užitečná pro cytologická studia, protože umožňuje pozorování specifických buněčných struktur. Tato technika barví cytoplazmy, jádra, jádra, vakuoly a granule buněk a je schopna rozlišit i jemné stopy chromatinu.

Dále mohou být detekovány významné změny ve velikosti, tvaru nebo zbarvení jádra, kde je možné vizualizovat ztrátu vztahu mezi jádrem a cytoplazmou.

Na druhé straně umožňuje identifikovat nezralé buňky v kostní dřeni a periferní krvi, což je důležité pro diagnostiku závažných onemocnění, jako je leukémie. Je také možné detekovat mimo jiné hemoparazity, extra a intracelulární bakterie, houby.

V cytogenetice je široce používán, protože je možné studovat mitózu buněk.

Základ barvení Giemsa

Barviva typu Romanowsky jsou založena na použití kontrastu mezi kyselými a bazickými barvivy, aby se dosáhlo zabarvení základní a kyselé struktury. Jak je vidět, existuje afinita kyselých barviv k barvení základních struktur a naopak.

Jako základní barvivo se používá methylenová modř a její oxidované deriváty (Azure A a Azure B), zatímco kyselým barvivem je eosin.

Kyselé struktury buněk jsou nukleové kyseliny, granule segmentovaných bazofilů, mimo jiné proto budou obarveny methylenovou modří.

V tomto stejném smyslu jsou základní struktury buněk hemoglobin a některé granule, jako jsou například granule obsažené v segmentovaných eosinofilech; tyto budou obarveny eosinem.

Na druhé straně, vzhledem k tomu, že methylenová modrá a azurová látka se vyznačují tím, že jsou metachromatickými barvivy, mohou poskytnout různým strukturám různý odstín podle zatížení polyaniontů, které mají.

Takto strategická kombinace základních a kyselých barviv dokáže vyvinout široké spektrum barev podle biochemických charakteristik každé struktury, procházení světle modrou, tmavě modrou, fialovou a fialovou barvou v případě kyselých struktur.

Zatímco zbarvení poskytované eosinem je stabilnější, vytváří barvy mezi červenooranžovým a lososem.

materiály

Materiály pro přípravu zásobního roztoku

Příprava zásobního roztoku vyžaduje navážení 600 mg práškového barviva Giemsa, měření 500 ml methanolu neobsahujícího aceton a 50 ml neutrálního glycerinu.

Jak připravit zásobní roztok

Umístěte těžký prášek Giemsa do malty. Pokud jsou hrudky, měly by být nastříkány. Následně přidejte značné množství měřeného glycerinu a dobře promíchejte. Získaná směs se nalije do velmi čisté jantarové láhve.

Zbytek glycerinu se umístí do malty. Smíchejte znovu, abyste vyčistili zbytek barviva, které se přilepilo ke stěnám malty, a nalil do stejné nádoby.

Láhev se uzavře a umístí na 2 hodiny do vodní lázně při 55 ° C. Zatímco je ve vodní lázni, jemně protřepávejte směs každou půl hodinu.

Následně se směs nechá vychladnout, aby se umístil alkohol. Dříve se část odměřeného alkoholu umístí do malty, aby se dokončilo promytí zbývajícího barviva, a poté se přidá ke směsi spolu se zbytkem alkoholu.

Tento přípravek by měl být ponechán zrát nejméně 2 týdny. Použitá část zásobního roztoku by měla být filtrována.

Aby se předešlo kontaminaci přípravku, doporučuje se část, která bude neustále používána, přenést do malé jantarové láhve s kapátkem. Doplňte pokaždé, když dojde činidlo.

Materiály pro přípravu roztoku pufru

Na druhé straně je pufrový roztok o pH 7,2 připraven takto:

6,77 g fosforečnanu sodného (bezvodého) (NaHPO ₄), 2,59 g dihydrogenfosforečnanu draselného (KH ₂ PO ₄) a destilované vody se naváží do 1000 ccm.

Konečná příprava barviva

Pro přípravu konečného barvicího roztoku změřte 2 ml filtrovaného zásobního roztoku a smíchejte se 6 ml pufrového roztoku. Směs se promíchá.

Důležitou skutečností, kterou je třeba vzít v úvahu, je to, že se techniky přípravy barviv mohou měnit v závislosti na komerčním domě.

Další materiály potřebné k provedení zbarvení

Kromě popsaných materiálů musíte mít k dispozici barvicí můstky, trička s vodou nebo pufrem na mytí, skluzavky nebo obaly na předměty, stopky pro kontrolu doby zbarvení a savý papír nebo nějaký materiál, který lze použít k vysušení (gáza nebo bavlna).

Technika

Proces barvení

1) Před barvením musí být stěr vzorku připraven na čistém sklíčku.

Vzorky mohou být vzorky krve, kostní dřeně, histologické tkáňové řezy nebo vzorky děložního čípku. Před barvením se doporučuje, aby pomazánky byly tenké a měly 1 až 2 hodiny sušení.

2) Na barvicí můstek umístěte všechny listy, které mají být obarveny. Vždy pracujete ve stejném pořadí a každý list je dobře identifikován.

3) Na stěru naneste několik kapek 100% methanolu (methanol) a nechte působit 3 až 5 minut, aby se vzorek fixoval a dehydratoval.

4) Zlikvidujte přítomný methanol na desce a nechte uschnout na vzduchu.

5) Po zaschnutí vložte konečný barvicí roztok kapátkem, dokud nebude celý list zakryt. Nechte působit 15 minut. Někteří autoři doporučují až 25 min. Záleží na obchodním domě.

6) Skvrnu vypusťte a stěr vypláchněte destilovanou vodou nebo 7,2 pufrového roztoku.

7) Na savý papír nechte listy vyschnout na čerstvém vzduchu, uspořádané svisle pomocí podpěry.

8) Očistěte zadní stranu sklíčka alkoholovým tampónem nebo vatovým tamponem, abyste odstranili veškeré skvrny.

Utility

Technika barvení Giemsa se používá v různých oblastech, včetně: hematologie, mykologie, bakteriologie, parazitologie, cytologie a cytogenetiky.

Hematologie

Jedná se o nejčastější použití této skvrny. S ním lze identifikovat každou z buněk přítomných ve vzorcích kostní dřeně nebo periferní krve. Stejně jako odhad počtu každé série, schopnost detekovat leukocytózu nebo leukopenii, trombocytopenii atd.

Protože je citlivý na identifikaci nezralých buněk, je důležitý v diagnostice akutních nebo chronických leukémií. Je také možné stanovit diagnózu anémie, jako je srpkovitá anémie, srpkovitá buňka atd.

Mykologie

V této oblasti je její použití běžné při hledání Histoplasma capsulatum (intracelulární dimorfní houba) ve vzorcích tkání.

Bakteriologie

U hematologických nátěrů obarvených Giemsou je možné detekovat Borrelias sp u pacientů, kteří trpí onemocněním zvaným opakující se horečka. Spirochety jsou hojné mezi erytrocyty ve vzorcích odebraných na vrcholu horečky.

V infikovaných buňkách je také možné vizualizovat intracelulární bakterie, jako je Rickettsia sp a Chlamydia trachomatis.

parazitologie

V oblasti parazitologie umožňuje barvení Giemsa diagnostikovat parazitární choroby, jako je malárie, Chagasova choroba a leishmanióza.

V prvních dvou parazitech Plasmodium sp a Trypanosoma cruzi lze pozorovat v periferní krvi infikovaných pacientů, lze je nalézt v různých stádiích v závislosti na fázi, ve které je nemoc.

Pro zlepšení hledání parazitů v krvi se doporučuje použít barvení Giemsa smíchané s barvením May-Grünwald.

Podobně může být kožní leishmanióza diagnostikována vyhodnocením vzorků kůže biopsie obarvené Giemsou, kde se nachází parazit.

Cytologie

Giemsa barvení se také používá pro cytologické studium endocervikálních vzorků, ačkoli to není nejčastěji používanou technikou pro tento účel.

Ale v případě nedostatku zdrojů může být použit, který má podobnou funkčnost jako ta, která nabízí technika Papanicolaou, a to za nižší cenu. Vyžaduje však odbornost na straně zkoušejícího.

Cytogenetika

Relevantní vlastností barvení Giemsa je jeho schopnost vázat se silně na oblasti DNA bohaté na adenin a thymin. To umožňuje vizualizaci DNA během buněčné mitózy v různých stavech kondenzace.

Tyto studie jsou nezbytné k detekci chromatických aberací, jako jsou duplikace, delece nebo translokace různých oblastí chromozomů.

Výzkum prokazující účinnost barvení Giemsa

Cannova et al (2016), porovnali 3 barvicí techniky pro diagnostiku kožní leishmaniózy.

K tomu použili vzorky získané z pokusného zvířete (Mesocrisetus auratus) experimentálně naočkovaného Leishmanias.

Autoři prokázali, že barvení Giemsa bylo lepší než barvení Pap-mart® a Gaffney. Proto považovali skvrnu Giemsa za ideální pro diagnostiku kožní leishmaniózy.

Vynikající výsledky získané autory jsou způsobeny skutečností, že kombinace barviv, která tvoří směs Giemsa, představuje nezbytné podmínky pro vytvoření příznivého kontrastu, což umožňuje jasně rozlišit struktury amastigot, jak uvnitř, tak i extracelulárně.

Udělali to i jiné techniky (Pap-mart® a Gaffney), ale slabším způsobem, a proto je obtížnější je vizualizovat. Proto se barvení Giemsa doporučuje pro parazitologickou diagnostiku leishmaniózy.

Podobně studie Ramírez et al (1994) hodnotila platnost Giemsa a Lendrumových skvrn ve spojivkových nátěrech pro identifikaci Chlamydia trachomatis.

Autoři určili, že skvrny Giemsa a Ledrum mají stejnou specificitu, ale bylo zjištěno, že Giemsa je citlivější.

To vysvětluje, proč je barvení Giemsa v současnosti nejčastěji používáno pro diagnostiku chlamydiových infekcí, zejména pokud je k dispozici málo zdrojů.

Zdroj: Reagencie ITR společnosti PanReac Applichem. Giemsa skvrna. Verze 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Španělsko.

Doporučení pro dobré barvení

Sušení listů by nemělo být urychleno. Očekává se, že bude vyschnuto na čerstvém vzduchu přiměřené množství času. Přibližně 2 hodiny.

Nejlepších výsledků dosáhnete okamžitě po 2 hodinách.

Aby se nátěry lépe fixovaly a barvily, musí být vzorek rozložen na sklíčku tak, aby zůstala tenká a stejnoměrná vrstva.

Výhodným vzorkem krve je kapilára, protože nátěr se vyrábí přímo z kapky krve, a proto vzorek neobsahuje žádné přísady, což zvýhodňuje udržování buněčných struktur.

Je-li však použita žilní krev, měla by být EDTA použita jako antikoagulační látka a nikoli heparin, protože heparin obvykle deformuje buňky.

Časté chyby při barvení Giemsou

V praxi tohoto zbarvení může dojít. Dokládají to náhlé změny v tonalitách struktur.

Extrémně modré zbarvení

Může to být způsobeno:

• Velmi silné nátěry
• Překročení doby barvení
• Mytí nedostatečně.
• Použití činidel výrazně nad neutrálním (alkalickým) pH.

Za těchto podmínek jsou barvy následujících struktur zkresleny tak, aby se erytrocyty místo barvení lososově růžové objevily zelené, granule eosinofilů, které musí být obarveny cihlově červenou, se zbarví namodralě nebo šedě a tak dále odchylka v obvyklých tónech.

Nadměrně růžové zbarvení

Může to být způsobeno:

• Nedostatečná doba barvení.
• Prodloužené nebo nadměrné praní.
• Špatné sušení.
• Použití vysoce kyselých činidel.

V tomto konkrétním případě nebudou struktury, které normálně zafarbí modrou, téměř vidět, zatímco struktury, které zafarbí růžově, budou mít velmi přehnané odstíny.

Příklad: Červené krvinky se změní na jasně červenou nebo jasně oranžovou, jaderný chromatin se objeví světle růžový a eozinofilní granule zbarví tmavě jasně červenou.

Přítomnost sraženin v nátěru

Příčiny mohou být:

• Používejte špinavé nebo špatně omyté filmy.
• Nedovolte, aby nátěr dobře vyschl.
• Ponechání fixačního roztoku příliš dlouho.
• Nedostatečné mytí na konci zabarvení.
• Nedostatečná filtrace nebo žádná filtrace použitého barviva.

Přítomnost morfologických artefaktů

Morfologické artefakty se mohou objevit v nátěrech, což ztěžuje vizualizaci a interpretaci přítomných struktur. Důvodem je:

• Typ použitého antikoagulantu, jako je heparin.
• Použití špinavých, poškozených nebo mastných filmů.

Režim úložiště

Po přípravě musí být barvivo udržováno při pokojové teplotě (15 - 25 ° C), aby se zabránilo vysrážení barviva. Měl by být uložen v těsně uzavřené jantarové nádobě.

Reference

1. Cannova D, Brito E a Simons M. Hodnocení technik barvení pro diagnostiku kožní leishmaniózy. Salus. 2016; 20 (2): 24-29.
2. Reagencie ITR společnosti PanReac Applichem. Giemsa skvrna. Verze 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Španělsko.
3. Clark G. Barvení postupy (1981), 4thed. Williams & Willkins.
4. Aplikovaná klinická chemie. Giemsa skvrna pro diagnostiku in vitro. Distributor: cromakit.es
5. Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F a Grazioso C. Platnost skvrn Giemsa a Lendrum ve spojovacích nátěrech pro identifikaci Chlamydia trachomatis. Bol Sanit Panam. 1994; 116 (3): 212-216.
6. Casas-Rincón G. Obecná mykologie. 1994. 2. ed. Central University of Venezuela, Library Editions. Venezuela Caracas.
7. "Giemsa skvrna." Wikipedia, encyklopedie zdarma. 1. září 2017, 01:02 UTC. 6. prosince 2018, es.wikipedia.org.