ZIEHL-NEELSENOVO BARVENÍ: ZDŮVODNĚNÍ, ČINIDLA A TECHNIKA - BIOLOGIE - 2025

Ziehl-Neelsenovo barvicí technikou pro identifikaci mikroorganismů rezistentní kyseliny s alkoholem (ARA). Název tohoto mikrobiologického postupu se týká autorů: bakteriolog Franz Ziehl a patolog Friedrich Neelsen.

Tato technika je typem diferenciálního barvení, které zahrnuje použití různých barviv, aby se vytvořil kontrast mezi strukturami, které chcete pozorovat, rozlišovat a později identifikovat. Ziehl-Neelsenovo barvení se používá k identifikaci určitých typů mikroorganismů.

Ziehl-Neelsenovo barvení

Některé z těchto organismů jsou mykobakterie (např. Mycobacterium tuberculosis), nocardia (např. Nocardia sp.) A některé jednobuněčné parazity (např. Cryptosporidium parvum). Mnoho bakterií lze klasifikovat běžnou technikou zvanou Gramovo barvení.

Některé bakteriální skupiny však vyžadují jiné metody, aby je bylo možné identifikovat. Techniky, jako je Ziehl-Neelsenovo barvení, vyžadují kombinace barviv s teplem, aby se fixační látka fixovala na buněčnou stěnu.

Pak následuje bělicí proces, který umožňuje dva výsledky: odolnost nebo citlivost vůči změně barvy kyselinami a alkoholy.

Základ

Odůvodnění této barvicí techniky je založeno na vlastnostech buněčné stěny těchto mikroorganismů. Stěna je tvořena typem mastných kyselin zvaných mykolové kyseliny; Vyznačují se velmi dlouhými řetězci.

Pokud mají mastné kyseliny velmi dlouhé struktury, mohou snáze zadržovat barviva. Některé bakteriální rody jsou velmi obtížně barvitelné Gramovým barvením kvůli vysokému obsahu mykolových kyselin v buněčné stěně.

Skvrna Ziehl-Neelsen používá fenolovou sloučeninu karbol fuchsin, základní skvrnu. To má schopnost interagovat s mastnými kyselinami buněčné stěny, která je při pokojové teplotě vosková.

Barvení karbol fuchsinu je zlepšeno v přítomnosti tepla, protože se vosk roztaví a molekuly barviva se pohybují rychleji do buněčné stěny.

Kyselina, která se používá později, slouží k odbarvení buněk, které nebyly obarveny, protože jejich stěna nebyla dostatečně příbuzná barvivu; proto je síla kyselého bělidla schopna odstranit kyselé barvivo. Buňky, které odolávají tomuto zbarvení, se nazývají kyselinově rychlé.

Sekundární barvivo

Po odbarvení vzorku je kontrast s jiným barvivem zvaným sekundární barvivo. Obecně se používá methylenová modrá nebo malachitová zelená.

Sekundární barvivo obarví materiál na pozadí a následně vytváří kontrast ke strukturám, které byly obarveny v prvním kroku. Pouze zbarvené buňky absorbují druhé barvivo (kontrastní barvivo) a nabírají svou barvu, zatímco kyselinově rychlé buňky si zachovávají svoji červenou barvu.

Tento postup se často používá k identifikaci Mycobacterium tuberculosis a Mycobacterium leprae, které se nazývají kyselinově rychlé bacily.

Činidla

Primární barvivo

Používá se 0,3% karbol fuchsinu (filtrováno). Toto barvivo se připravuje ze směsi alkoholů: fenolu v ethanolu (90%) nebo methanolu (95%) a v této směsi se rozpustí 3 gramy bazického fuchsinu.

Bělicí roztok

V tomto kroku mohou být použity roztoky 3% alkoholu nebo 25% kyseliny sírové.

Sekundární barvivo (kontra-barvivo)

Barvivo, které se používá k porovnání vzorků, je obvykle 0,3% methylenové modři. Lze však použít i jiné, například 0,5% malachitové zeleně.

Technika

Postup barvení kyselinou

Připravte bakteriální nátěr

Tento přípravek se provádí na čistém a suchém sklíčku podle opatření ke sterilitě.

Sušení stěrem

Nechte nátěr zaschnout při pokojové teplotě.

Zahrejte vzorek

Vzorek by se měl zahřát ohněm na podložní sklíčko níže. Fixaci alkoholu lze provést, pokud nátěr nebyl připraven sputem (ošetřeno chlornanem sodným, aby došlo k jeho bělení), a pokud se nezbarví okamžitě.

M. tuberculosis se odstraní bělením a během procesu barvení. Tepelná fixace neošetřeného sputa nezabije M. tuberculosis, zatímco fixace alkoholu je baktericidní.

Zakryjte skvrnu

Skvrna je pokryta fuchsinovým roztokem karbolu (primární základní skvrna).

Zahřívejte skvrnu

To se provádí po dobu 5 minut. Měli byste si všimnout vývoje páry (přibližně 60 ° C). Je důležité nepřehřívat se a vyhnout se spálení vzorku.

Pokud jde o zahřívání skvrny, musí být při zahřívání karbol fuchsinu věnována velká pozornost, zejména pokud se zabarvení provádí na podnose nebo jiné nádobě, ve které byly shromážděny vysoce hořlavé chemikálie z předchozího zabarvení.

Pod sklíčka by měl být použit pouze malý plamen pomocí dříve zapáleného tamponu navlhčeného několika kapkami kyselého alkoholu, methanolu nebo 70% ethanolu. Nepoužívejte velký tampon namočený v ethanolu, protože to představuje nebezpečí požáru.

Omyjte skvrnu

Toto mytí musí být provedeno čistou vodou. Pokud voda z vodovodu není čistá, omyjte stěru nejlépe filtrovanou nebo destilovanou vodou.

Zakryjte nátěr kyselým alkoholem

Tento kyselý alkohol by měl být na 3%. Pokrytí se provádí po dobu 5 minut nebo dokud není nátěr dostatečně zbarven, tj. Světle růžové barvy.

Je třeba vzít v úvahu, že kyselý alkohol je hořlavý; proto musí být používán s velkou péčí. Vyvarujte se blízkosti zdrojů zapálení.

Omyjte skvrnu

Mytí by mělo být prováděno čistou destilovanou vodou.

Zakryjte nátěr skvrnou

Může to být malachitově zelená (0,5%) nebo methylenová modrá (0,3%) skvrna po dobu 1 až 2 minut, s delší dobou, pokud je nátěr tenký.

Omyjte skvrnu

Opět by měla být použita čistá (destilovaná) voda.

Odtok

Zadní část sklíčka by měla být vyčištěna a skvrna umístěna na drenážní stojan, aby mohla zaschnout na vzduchu (k sušení nepoužívejte absorpční papír).

Prohlédněte si nátěr pod mikroskopem

Musí být použit objektiv a imerzní olej 100X. Systematicky skenujte nátěr a zaznamenejte příslušná pozorování.

Interpretujte výsledky

Teoreticky jsou mikroorganismy, které barví načervenalé barvy, považovány za kyselinově pozitivní (AAR +).

Naopak, pokud se mikroorganismy zbarví modře nebo zeleně, v závislosti na barvivu použitém jako kontrastní barvivo, považují se za kysele rychle negativní (AAR-).

Reference

1. Apurba, S. & Sandhya, B. (2016). Základy praktické mikrobiologie (1. vydání). Jaypee Brothers Medical Publishers.
2. Bauman, R. (2014). Mikrobiologie s chorobami tělního systému (4. vydání). Pearson Education, Inc.
3. Heritage, J., Evans, E. & Killington, A. (1996). Úvodní mikrobiologie (1. vydání). Cambridge University Press.
4. Morello, J., Granato, P. Wilson, M. & Morton, V. (2006). Laboratorní příručka a pracovní sešit v mikrobiologii: Aplikace pro péči o pacienty (11. vydání). McGraw-Hill Education.
5. Vasanthakumari, R. (2007). Učebnice mikrobiologie (1. vydání). Publikace BI PVT.