Agar Simmons citrát, že je pevný médium jako biochemické identifikace testovaných mikroorganismů, zejména gram - negativní bacily. Původní médium vytvořil Koser v roce 1923.
Koserovo citrátové médium sestávalo z média obsahujícího fosforečnan sodný, fosforečnan amonný, fosforečnan monodraselný, síran hořečnatý a citrát sodný.
A. Komerční médium s citronovým citronem Simmons citrát B. Připravený citrátový citron Simmons. Zdroj: A. Fotografie pořízená MSc. Marielsa Gil B. Roto2esdios, z Wikimedia Commons
Jak je vidět, jediným zdrojem uhlíku v médiu je citrát a dusík je fosforečnan amonný, vynechávající proteiny a uhlohydráty jako zdroj těchto prvků, jsou běžně přítomny v jiných médiích.
Bakterie naočkované tímto médiem se proto mohou rozmnožovat, pouze pokud jsou schopny absorbovat uhlík z citrátu. Test byl pozitivní, pokud v médiu bylo zakalení, mělo však tu nevýhodu, že by mohlo dojít ke nespecifickému zakalení.
Tento problém byl vyřešen Simmons přidáním bromtymolové modři a agaru do Koserovy původní receptury. Ačkoli je zásada stejná, je interpretována odlišně.
Základ
Některé bakterie mají schopnost přežít v nepřítomnosti kvašení nebo produkce kyseliny mléčné, které potřebují získat energii pomocí jiných substrátů. V tomto testu je jediným nabízeným zdrojem uhlíku citrát.
Bakterie, které jsou schopné přežít za těchto podmínek, rychle metabolizují citrát jako alternativu k tradičnímu způsobu, za použití cyklu kyseliny trikarboxylové nebo fermentačního cyklu citrátu.
Katabolismus citrátu bakteriemi zahrnuje enzymatický mechanismus bez zásahu koenzymu A. Tento enzym je znám pod názvem citrikáza (citrát oxaloacetát-lyáza) nebo citrát desmolasa. Reakce vyžaduje přítomnost dvojmocného kationtu, který je v tomto případě dodáván hořčíkem.
Reakcí se generuje oxaloacetát a pyruvát, které pak vedou ke vzniku organických kyselin uprostřed alkalického pH vytvořeného použitím zdroje dusíku. Tyto organické kyseliny se používají jako zdroj uhlíku vytvářející uhličitany a hydrogenuhličitany, což dále alkalizuje životní prostředí.
Výsevní režim
Citronové médium Simmons by mělo být lehce naočkováno do rybího tuku pomocí přímé smyčky nebo jehly a inkubováno po dobu 24 hodin při 35-37 ° C. Po uplynutí času jsou výsledky pozorovány.
Očkování se provádí pouze na povrchu agaru. Nepropichujte.
Výklad
Pokud médium zůstane původní barvy (zelená) a nedochází k viditelnému růstu, je test negativní, ale pokud médium zmodrá, znamená to přítomnost alkalických produktů, která je detekována indikátorem pH. V tomto případě je test pozitivní.
Citrát (+) a (-). Zdroj: MSc. Marielsa gil
K tomu dochází, protože pokud bakterie používá uhlík citrátu, je také schopna vzít dusík fosforečnanu amonného, s nímž uvolňuje amoniak, alkalizuje médium.
Na druhé straně, pokud je růst bakterií pozorován v médiu, ale nedochází k žádné změně barvy, musí být test považován také za pozitivní, protože pokud dojde k růstu, znamená to, že bakterie byly schopné použít citrát jako zdroj uhlíku, i když v současné době nedochází ke změně pH (někdy to může trvat čas).
Pokud jsou pochybnosti o interpretaci konečné barvy, lze ji porovnat s nenaočkovanou citrátovou zkumavkou.
Příprava
Naváží se 24,2 g dehydratovaného média na jeden litr vody. Promíchejte a nechte asi 5 minut odpočívat. Rozpouštění média dokončete zahříváním po dobu 1 nebo 2 minut za častého třepání.
Nalijte 4 ml do zkumavek a autoklávujte při 121 ° C po dobu 15 minut. Při opuštění autoklávu nakloňte pomocí podpěry tak, aby agar ztuhl ve tvaru flétny zobáku s malým blokem nebo dnem a více zkoseným.
Konečné pH citrátového média je 6,9 (zelená barva). Toto médium je velmi citlivé na změny pH.
Při pH 6 nebo nižším se médium změní na žluté. Tato barva není v testu bakterií pozorována.
A při pH 7,6 nebo vyšším se médium změní na pruskou modrou.
Použití
Citronový agar Simmons se používá k identifikaci určitých mikroorganismů, zejména bacilů patřících do čeledi Enterobacteriaceae a jiných ne-glukózových fermentujících bacilů.
Zdroj: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
Závěrečné myšlenky
Simmons Citrate Medium je velmi choulostivý test, protože pokud dojde k určitým chybám, lze získat falešná pozitiva.
Je třeba dbát na následující:
Inokulum
Nemělo by být vytvořeno velmi silné nebo naložené bakteriální inokulum, protože to může způsobit vznik měděné žluté barvy v místě výsadby, aniž by to ovlivnilo zbytek média, ale může to vést k domněnce, že dochází k růstu. Neznamená to pozitivitu testu.
Silné inokulum může také vytvářet falešně pozitivní, protože organické sloučeniny vytvořené uvnitř buněčných stěn umírajících bakterií mohou uvolňovat dostatek uhlíku a dusíku, aby se změnil indikátor pH.
Ideální je tedy setí pomocí jehly místo držadla platiny, aby nedošlo k odebrání nadbytečného materiálu.
Zaseté
Na druhé straně, když se nasadí sada biochemických testů pro identifikaci daného mikroorganismu, je důležité, aby byl citrátový test první naočkován, aby se zabránilo přenosu proteinů nebo uhlohydrátů z jiného média.
Za této okolnosti je možné získat falešně pozitivní, protože každá z těchto látek, které jsou zaváděny omylem, bude metabolizována a způsobí změnu pH.
Dalším způsobem, jak se vyhnout přenosu látek, je řádné spálení smyčky a přijetí nového inokula mezi jednotlivými testy.
Při provádění inokula je třeba věnovat pozornost i dotyku kolonie, protože je třeba se vyhnout tomu, aby byla část agaru vytažena z kultury, ze které pocházejí bakterie, což je vysvětleno výše.
V tomto smyslu Matsen, Sherris a Branson doporučují ředění inokula ve fyziologickém roztoku před naočkováním citrátového testu, aby nedošlo k přenosu jiných zdrojů uhlíku.
Intenzita barev
Mělo by se vzít v úvahu, že intenzita barvy vytvořené v případě pozitivního testu se může lišit podle komerčního domu.
Kromě toho existují mikroorganismy, které testují pozitivní po 24 hodinách, ale existují i jiné kmeny, které vyžadují 48 hodin nebo více, aby vyvolaly změnu pH.
Reference
- Mac Faddin J. (2003). Biochemické testy pro identifikaci bakterií klinického významu. 3. ed. Editorial Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey a Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
- Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
- Laboratoře BD. BBL Simmons Citrate Agar Slants. 2015.K dispozici na: bd.com
- Britannia Laboratories. Simmons Citrate Agar. 2015.K dispozici na: britanialab.com
- Diagnostické laboratoře Valtek. Simmons Citrate Agar. 2016. K dispozici na: andinamedica.com.