STANDARDNÍ AGAROVÝ KORÁLEK: ODŮVODNĚNÍ, PŘÍPRAVA A POUŽITÍ - BIOLOGIE - 2025

Standardní počet agar je pevný, neselektivní kultivační médium, určené pro kvantifikaci aerobní mikrobiální zatížení přítomné ve vzorcích pitné vody, odpadní vody, mléčných nápojů, mezi jiné potraviny. Toto médium je také známé jako PCA agar, pro jeho zkratku v anglickém Plate Count Agar. Byl vytvořen v roce 1953 Buchbinderem, Barisem a Goldsteinem.

Médium pro standardní počet agarů se skládá z kvasničného extraktu, tripteinu, glukózy, agaru a destilované vody. Tato formulace obsahuje základní výživové prvky, které umožňují vývoj současné aerobní mikrobiální zátěže, aniž by to vyžadovalo.

Desetinná ředění pro počítání CFU ve standardních počtech agarů. Zdroj: Quentin Geissmann

Protože médium neobsahuje inhibitory, bakterie mohou růst bez jakýchkoli omezení, což je ideální pro obecné počítání kolonií. Technika kvantifikace destičky však nedetekuje všechny přítomné bakterie, ale pouze ty, které jsou schopné růst za podmínek prostředí, kterým je agar s počty standardních mikroorganismů podroben.

V tomto smyslu se technika kvantifikace desek obecně snaží stanovit množství bakterií aerobního mezofilního typu, tj. Bakterií, které rostou při teplotách mezi 25 a 40 ° C, s optimální růstovou teplotou 37 ° C..

Tato bakteriální skupina je velmi důležitá, protože se zde nachází většina patogenních bakterií pro člověka.

Je třeba poznamenat, že někdy může být zajímavé kvantifikovat množství psychrofilních bakterií přítomných v potravě. Tyto bakterie jsou ty, které rostou při nízkých teplotách (<20 ° C) a jsou odpovědné za rychlejší rozklad potravin, i když jsou chlazeny.

Podobně i termofilní bakterie, které se vyvíjejí v rozmezí 50 až 80 ° C nebo více, mohou být důležité v určitých typech potravin, jako jsou konzervované potraviny.

Mikrobiální kvantifikace je vyjádřena v jednotkách vytvářejících kolonie (CFU) na gram nebo mililitr vzorku.

Základ

Médium pro standardní počítání je navrženo tak, aby umožňovalo úspěšný růst nestabilních aerobních bakterií, protože kvasnicový extrakt, triptein a glukóza poskytují živiny nezbytné pro dobrý mikrobiální růst.

Na druhé straně má médium světlou barvu a průhledný vzhled, a proto je ideální pro vizualizaci kolonií vyvinutých metodou hlubokého výsevu (nalití do talíře).

Počítání kolonií metodou očkování povrchu stěrky Drigalski je také možné.

Pokud je mikrobiální zátěž vysoká, musí být provedeno desetinné ředění vzorku studie, aby bylo možné spočítat CFU.

Je třeba poznamenat, že toto médium je doporučeno sdružením American Public Health Association (APHA) pro počet aerobních mezofilů.

Příprava

Naváží se 23,5 g dehydratovaného média a rozpustí se v litru destilované vody. Aby se směs úplně rozpustila, měla by být směs zahřívána častým mícháním, dokud se nevaří. Následující kroky závisí na použité očkovací technice.

Pro techniku ​​lití destiček

Distribuujte rozpuštěním 12 až 15 ml do zkumavek. Následně se sterilizuje v autoklávu při 121 ° C po dobu 15 minut. Nechte vertikálně tuhnout ve tvaru bloku. Skladujte v chladničce až do použití.

Když jej budete používat, roztavte zástrčku. Po roztavení uchovávejte ve vodní lázni při 44–47 ° C, dokud jsou vzorky připraveny.

Pro výsev na povrch

Médium sterilizujte v autoklávu při 121 ° C a poté rozdělte 20 ml do sterilních Petriho misek. Nechte ztuhnout, obraťte se a uložte do chladničky do použití.

Desky před použitím temperujte. PH média by mělo být 7,0 ± 0,2.

Použití

Standard Count Agar se používá v aerobní mezofilní technice počítání při mikrobiologické analýze vody a jídla. Počet aerobních mezofilů je nezbytný, protože určuje hygienickou kvalitu zkoumaného vzorku.

Použití této techniky (za použití tohoto média) umožňuje makroskopickou vizualizaci izolovaných kolonií pro jejich kvantifikaci.

Technika lití desek (hloubkové setí)

-Proces

Tato technika se skládá z následujících:

1) Homogenizujte vzorek, aby se rozložily přítomné bakterie.

2) Počáteční suspenze se připraví ve sterilní láhvi nebo vaku, přičemž se respektuje poměr 10 gramů nebo 10 ml vzorku v 90 ml ředidla (^10-1).

3) Z počáteční suspenze se provede příslušná desetinná ředění v závislosti na typu vzorku. Příklad: (^10-2, ^10-3, ^10-4). Ředění se provádí peptonovou vodou nebo fosfátovým pufrem.

K tomu se 1 ml výchozí suspenze a umístit jej v 9 ml ředidla, pokračovat v ředění, pokud je to nutné, se při 1 ml na 10 ^-2 ředění, a tak dále.

4) Vezměte 1 ml každého ředění a vložte do prázdných sterilních Petriho misek.

5) Na každou destičku se přidá 12 až 15 ml standardního počtu agarů, které byly předtím roztaveny a usadeny při 44 - 47 ° C.

6) Jemně otáčejte destičkami, aby se vzorek rovnoměrně rozmístil po agaru a nechte jej ztuhnout.

7) Invertujte destičky a inkubujte při aerobióze při 37 ° C po dobu 24 až 48 hodin.

8) Na konci času se destičky prozkoumají a kolonie se spočítají v ředění, které to umožňuje. Pro počet se vyberou desky, které mají mezi 30 až 300 CFU.

Počítání lze provést ručně nebo můžete použít zařízení pro počítání kolonií.

Hodnoty povolené na ml vzorku se mohou v jednotlivých zemích lišit v závislosti na předpisech, kterými se řídí.

-Výpočet UFC

Obecný výpočet se provádí pomocí následujícího vzorce:

Vzorec pro obecný výpočet kvantifikace CFU. Zdroj: Národní správa léčiv, potravin a lékařských technologií (ANMAT). Mikrobiologická analýza potravin, oficiální analytická metodologie, indikátorové mikroorganismy. 2014 Svazek 3. K dispozici na adrese: anmat.gov.ar

Vyjádřete výsledky 1 nebo 2 číslicemi, vynásobte příslušnou základnou 10. Příklad: v případě, že výsledek je 16,545, je zaoblený, vztaženo na třetí číslice do 17.000 a bude vyjádřit takto: 1,7 x 10 ⁴. Nyní, pokud je výsledek byly 16436, okolo toho 16,000 a vyjádřit 1,6 x 10 ⁴.

Technika očkování povrchu

-Proces

- Inokulujte 0,1 ml přímého vzorku, je-li kapalný, počáteční suspenze 10 ^-1 nebo po sobě jdoucích ředění 10 ^-2, 10 ^-3 atd., Ve středu standardní agarové plotny.

- Rozložte vzorek rovnoměrně špachtlí Drigalski nebo skleněnou tyčí ve tvaru písmene L. Nechte jej 10 minut odpočívat.

- Invertujte destičky a inkubujte aerobně při 37 ° C po dobu 24 až 48 hodin.

- Pokračujte v počítání kolonií, vyberte ty desky, které jsou v rozmezí mezi 20 - 250 CFU.

-Výpočet UFC

Pro výpočet se použije ředicí faktor, který je inverzní. Číslo je zaokrouhleno na 2 významné číslice (zaokrouhleno podle třetí číslice) a vyjádřeno jako síla základny 10. Pokud je například ve vzorku počítáno 224 CFU bez ředění (10 ^-1), vykazuje se 22 x 10 ¹ CFU., ale pokud to bylo 225, uvede se 23 x 10 ¹ CFU.

Nyní, pokud 199 CFU se počítají v 10 ^-3 ředění, 20 x 10 ⁴ CFU budou uvedeny, ale v případě, 153 CFU se počítají ve stejném ředění 15 x 10 ⁴ CFU budou uvedeny.

QA

Kultivační médium pro standardní počet lze hodnotit pomocí známých certifikovaných kmenů, jako jsou: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.

Pokud je kultivační médium v ​​optimálních podmínkách, očekává se ve všech případech uspokojivý růst, s výjimkou L. fermentum, který může mít pravidelný výnos.

Aby se vyhodnotila sterilita kultivačního média, měla by se jedna nebo dvě plotny každé připravené šarže (bez inokulace) inkubovat při 37 ° C v aerobióze po dobu 24 hodin. Po uplynutí této doby by se v médiu nemělo pozorovat růst ani změna barvy.

Omezení

- Neroztavujte agar více než jednou.

- Připravené médium může trvat až 3 měsíce, pokud je uchováváno v chladničce a chráněno před světlem.

- Toto médium není vhodné pro náročné nebo anaerobní mikroorganismy.

Reference

1. Národní správa léčiv, potravin a lékařské technologie (ANMAT). Mikrobiologická analýza potravin, oficiální analytická metodologie, indikátorové mikroorganismy. 2014 Svazek 3. K dispozici na adrese: anmat.gov.ar
2. Laboratorios Difco Francisco Soria Melguizo, SA Plate Count Agar. 2009. K dispozici na adrese:
3. Conda Pronadisa Laboratories. Agar standardní metody (PCA) podle APHA a ISO 4833. K dispozici na adrese: condalab.com
4. Britannia Laboratories. Počet agarových destiček. 2015.K dispozici na: britanialab.com
5. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B a Velázquez O. 2009. Techniky pro mikrobiologickou analýzu potravin. 2. ed. Fakulta chemická, UNAM. Mexiko. K dispozici na adrese: depa.fquim.unam