Agar EMB je selektivní a diferenciální médium používané pro pevné izolaci kultivačního Gram negativních bakterií, zejména Enterobacteriaceae a jiných gramnegativních bakterií nenáročné. Je známá také zkratkou EAM, která označuje eosin-methylenovou modrou.
Toto médium vytvořili Holt-Harris a Teague v roce 1916. Obsahuje pepton, laktózu, sacharózu, fosforečnan draselný, agar, eosin, methylenovou modrou a vodu. Je velmi podobný agaru MacConkey, zejména při použití Levinova modifikovaného EMB agaru, který neobsahuje sacharózu.
Kovový lesk Escherichia coli na EMB agaru Zdroj: Carmen Moreno González, Wikimedia Commons
Ve skutečnosti každá laboratoř rozhodne, zda bude pracovat s jedním nebo druhým, protože plní stejnou funkci, i když biochemicky se liší.
Má dokonce stejnou nevýhodu jako klasický MacConkey agar, pokud jde o rojovou produkci rodu Proteus. Aby se tomuto jevu zabránilo, může být koncentrace agaru zvýšena až o 5%.
Základ
Selektivní
EMB agar je jemně selektivní, protože obsahuje anilinová barviva (eosin a methylenová modř), která působí jako inhibitory a brání růstu většiny grampozitivních bakterií a některých náročných gramnegativních tyčinek.
Tento agar má však tu nevýhodu, že některé grampozitivní bakterie mohou odolávat přítomnosti inhibičních látek a rostou jako malé bezbarvé punkční kolonie, jako je Enterococcus faecalis a některé Staphylococcus.
Mohou také růst některé kvasinky, například komplex Candida albicans, který poskytne velmi malé růžové kolonie. Chlamydospory se mohou z těchto kvasinek vyvinout, pokud je vzorek hluboce očkovaný.
Rozdíl
Na druhé straně je EMB agar také diferenčním médiem, protože tato barviva společně (eosin a methylenová modrá) mají schopnost vytvářet sraženinu při kyselém pH, a proto slouží jako ukazatele její produkce.
Slabé bakterie fermentující laktózu nebo sacharózu tedy produkují purpurové kolonie během 24 až 48 hodin. Například rody Klebsiella, Enterobacter a Serratia.
Bakterie, které silně fermentují laktózu, jako je Escherichia coli nebo sacharóza, jako je Yersinia enterocolitica nebo Proteus penneri, tvoří zeleno-černou sraženinu, která u těchto druhů dává charakteristický kovový lesk.
Je třeba poznamenat, že pokud se použije levinové médium EMB (bez sacharózy), Yersinia enterocolitica a Proteus penneri vytvoří jasné kolonie.
Bakterie, které nekvasí laktózu nebo sacharózu, se živí přítomností peptonů, které poskytují aminokyseliny a dusík nezbytné pro bakteriální růst, a produkují čiré kolonie. Například rod Salmonella a Shigella.
Stejně tak je důležité poznamenat, že rod Acinetobacter může představovat kolonie levandulově modré, i když nejde o fermentor laktózy nebo sacharózu, ale má vlastnost fixace methylenové modře na buněčné stěně. K tomu může dojít i u jiných oxidačních bakterií.
Příprava
Původní dehydrované médium je světle béžové barvy.
K přípravě tohoto kultivačního média musí být zváženo 36 gramů dehydratovaného média a suspendováno v baňce obsahující jeden litr destilované vody.
Po ponechání směsi po dobu 5 minut se baňka přivede ke zdroji tepla a intenzivně se míchá, dokud se zcela nezavře a nerozpustí.
Následně musí být již rozpuštěné kultivační médium sterilizováno pomocí autoklávu při 121 ° C po dobu 15 minut.
Na konci času se vyjme z autoklávu a nechá se krátce stát. Potom, ještě teplé (45-50 ° C), se v každé sterilní Petriho misce podává 15-20 ml agaru. Médium by mělo být lakmusově modré.
Po podání se desky ponechají mírně odkryté, dokud agar nepochladne. Poté se zakryjí a nechá se zcela ztuhnout. Následně jsou uspořádány v převrácených držácích desek a až do použití jsou uchovávány v lednici (8 ° C).
Tento postup se s výhodou provádí ve vrstvě s laminárním prouděním nebo před Bunsenovým hořákem, aby se zabránilo kontaminaci.
Je důležité mít na paměti, že v každém obchodním domě bude uvedeno množství, které má být zváženo, aby se připravilo kultivační médium.
Konečné pH média musí být 7,2 ± 0,2
Aplikace
Toto médium se používá k výsevu moči a výkalů nebo jakýchkoli typů klinických vzorků, zejména pokud existuje podezření na přítomnost nestabilních gramnegativních bacilů, jako jsou bacily patřící do čeledi Enterobacteriaceae, které na tomto médiu rostou velmi dobře.
Enteropatogenní bakterie rodu Shigella a Salmonella se vyznačují svými bezbarvými nebo slabě jantarovými koloniemi.
Rostou také jiné ne-laktózové fermentující bacily, jako jsou Aeromonas, Pseudomonas, Acinetobacter.
Stejně tak je toto médium velmi užitečné při mikrobiologické analýze potravin a vody, protože je ideální pro úplnou potvrzovací fázi stanovení koliformních bakterií, tj. Pro potvrzení přítomnosti E. coli z zakalených vývarů EC, nejpravděpodobnější číselné techniky (MPN).
QA
Aby se ověřilo, že čerstvě připravené kultivační médium funguje dobře, mohou být vysazeny kontrolní kmeny, aby se pozorovaly vlastnosti kolonií a ověřilo se, že dávají podle očekávání.
K tomu lze použít kmeny ATCC nebo dobře identifikované kmeny E. coli, Enterobacter aerogenes, Klebsiella sp, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Pseudomonas aeruginosa a některé grampozitivní bakterie, jako je S. aureus.
Očekává se, že E. coli vytvoří dobře vyvinuté modro-černé kolonie se zeleným kovovým leskem. Vzhledem k tomu, že Enterobacter aerogenes a Klebsiella sp by měly dávat dobře vyvinuté modro-černé sliznice.
Na druhé straně, Salmonella typhimurium a Shigella flexneri, musí vyvinout velké kolonie, bezbarvé nebo mírně jantarové barvy.
Konečně rod Pseudomonas aeruginosa roste jako bezbarvé kolonie nepravidelné velikosti, zatímco grampozitivní bakterie by měly být zcela inhibovány nebo řídce růst s velmi malými koloniemi.
Závěrečné myšlenky
Sterilizace někdy způsobí, že se methylenová modrá sníží a vykazuje středně oranžovou barvu. Aby methylenová modrá oxidovala a získala fialovou barvu, musí se jemně promíchat, dokud se barva neobjeví.
Po sterilizaci se může barvivo také vysrážet, proto by se mělo před podáváním Petriho misek dobře promíchat.
Reference
- Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B a Velázquez O. 2009. Techniky pro mikrobiologickou analýzu potravin. 2. ed. Fakulta chemická, UNAM. Mexiko.
- Carranza C, León R, Falcón N, Neumann A, Kromm C. Charakterizace a distribuce potenciálně patogenních kmenů Escherichia coli izolovaných z kuřat brojlerů z drůbežárenských farem v Peru. Rev. vet. Peru 2012 23 (2): 209-219. K dispozici na adrese: scielo.org.
- Laboratorios Conda SA Eosin a methylenový modrý agar. 2010. K dispozici na adrese: condalab.com
- Britannia Laboratories. Levine EMB (S eosinem a methylenovou modří) 2011. Dostupný na: britanialab.com
- Laboratoře BD. BD EMB Agar (Eosin Methylene Blue Agar), Modified. 2013. K dispozici na adrese: bd.com
- Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. (5. vydání). Argentina, Editorial Panamericana SA
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Argentina. Editorial Panamericana SA