LIA (LYSIN IRON) AGAR: ZALOŽENÍ, PŘÍPRAVA A POUŽITÍ - BIOLOGIE - 2025

Agar LIA (lysin železa) je biochemické zkoušky k identifikaci bakterií čeledi Enterobacteriaceae. Toto médium vytvořili Edwards a Fife na základě Falkowovy formule.

Původně byl tento test vývar obsahující peptony, kvasnicový extrakt, glukózu, L-lysin, bromokresolovou purpurovou a destilovanou vodu. Edwards a Fife přidali agar-agar, citrát železito-amonný a thiosíran sodný.

Pozitivní a negativní test na dekarboxylaci lysinu. Zdroj: Vlastnost fotografie a diagramu autora MSc. Marielsa gil

Test v podstatě spočívá v prokázání přítomnosti enzymu lysin dekarboxylázy, schopného reagovat s karboxylovou skupinou aminokyseliny L-lysinu. Deaminace aminokyseliny může také nastat v důsledku přítomnosti enzymu lysin deaminázy.

Navíc složení média vykazuje schopnost některých bakteriálních rodů produkovat sirovodík. Konečně je také možné pozorovat produkci nebo neprodukci plynu v médiu.

Základ

Extrakty z peptonů a kvasinek

Stejně jako většina kultivačních médií obsahuje Lysine Iron Agar složky, které poskytují zdroj živin nezbytných pro růst bakterií. Tyto složky jsou reprezentovány peptonem a kvasinkovým extraktem.

Glukóza

Podobně tento agar obsahuje glukózu jako fermentovatelný uhlohydrát. Je známo, že všechny bakterie z čeledi Enterobacteriaceae fermentují glukózu.

Tento krok je rozhodující, protože bude zodpovědný za okyselení média, což je nezbytná podmínka pro to, aby enzym lysin dekarboxyláza, pokud je přítomen, působil na jeho substrát.

U některých bakteriálních rodů lze pozorovat produkci plynu v důsledku fermentace glukózy.

Plyn se prokazuje, když se v zkumavce přemístí agar, čímž se ponechá prázdný prostor na dně zkumavky nebo zlomeninou média na dvě nebo více částí.

L-lysin

Jakmile je lysin dekarboxylován, vytvoří se diamin (kadaverin) a oxid uhličitý.

K dekarboxylaci dochází v přítomnosti koenzymu pyridoxal fosfátu. Tato reakce je nevratná.

Indikátor PH (bromokresolová fialová)

Všechny změny pH, ke kterým dochází v médiu různými reakcemi, jsou detekovány purpurovým bromokresolovým indikátorem pH.

V tomto smyslu, když dojde k okyselení, médium zžloutne a při alkalizaci se médium vrátí k původní fialové nebo fialové barvě.

Dojde-li k lysinové deaminaci v důsledku přítomnosti enzymu lysin deaminázy, na povrchu se vytvoří načervenalé zbarvení, typické pro rody Proteus, Providencia a některé druhy Morganella.

To je způsobeno tím, že během procesu deaminace se tvoří kyselina alfa-keto-karbonová, která reaguje s citronanem amonným v přítomnosti kyslíku, což způsobuje výše uvedenou barvu.

Citronan amonný a thiosíran sodný

Na druhé straně, bakterie, které produkují sirovodík bude doložena přítomnosti thiosíranu sodného (zdroj síry) a citrátem železitým amonný, který je developerem H ₂ S.

Bakterie, které mají enzym thiosíran reduktáza má schopnost působit prostředí snížením thiosíranu sodného přítomen, tvoří siřičitan a sirovodíku (H ₂ S).

Posledně jmenovaný je bezbarvý plyn, ale při reakci se solí železa vytváří sulfid železného kovu, což je nerozpustná sloučenina (viditelná černá sraženina).

Nicméně schopnost tvořit H ₂ S se toto médium není příliš spolehlivé, protože některé lysindekarboxylázového negativní bakterie schopné produkovat H ₂ S nebude tvořit černé sraženiny, jako kyselost středně zasahuje. Proto se doporučuje zkontrolovat u jiných médií, která obsahují železo.

Interpretace testu

Dekarboxylace lysinu

Zkumavky by se měly odečíst po 24 hodinách inkubace, jinak existuje riziko nesprávné interpretace reakce, hlášení falešných negativů.

Je třeba si uvědomit, že první reakcí, která nastane, bude fermentace glukózy, a proto všechny zkumavky po 10 až 12 hodinách zžloutnou.

Pokud je na konci inkubační doby (24 hodin) pozorováno žluté pozadí s fialovým nebo fialovým povrchem, je reakce negativní. Fialová barva povrchu odpovídá alkalizaci média pomocí peptonů.

Pozitivní reakce je taková, kde dno a povrch zkumavky jsou zcela fialové, to znamená, že se vrací do původní barvy.

Proto kdo určuje pozitivitu testu, je základem nebo pozadím média. Pokud máte pochybnosti o barvě, lze ji porovnat s ne naočkovanou zkumavkou LIA.

Deaminace lysinu

Trubice, která vykazuje deaminaci lysinu, bude mít načervenalý kaštanový povrch a žluté (kyselé) pozadí nebo celou trubku načervenalá kaštanová.

Tato reakce je interpretována jako negativní pro dekarboxylaci lysinu, ale pozitivní pro deaminaci lysinu.

Tato reakce je definována a interpretována na rámu.

Výroba sirovodíku (H

Pozitivní reakce je pozorována výskytem černé sraženiny v celém nebo části média. Obvykle mezi hranou zkosení a základnou.

Pokud se sraženina vyskytuje v celé zkumavce, neodhalí další reakce, ke kterým dochází uprostřed.

Záznam výsledků

Při interpretaci testu se výsledky zaznamenávají takto:

První úkos je číst, pak spodní nebo blok, pak produkce H ₂ S, a konečně na výrobu plynu.

Příklad: K / A + (-). To znamená:

• K: Alkalický rám (fialová barva)
• A: Kyselé pozadí (žluté), tj. Negativní dekarboxylační reakce a negativní deaminace.
• +: Výroba sirovodíku
• (-): Bez plynu.

Příprava

Naváží se 35 g dehydratovaného lysinového média se železným agarem a rozpustí se v jednom litru destilované vody.

Zahřejte, dokud se agar úplně nerozpustí, aby se to nechalo vařit minutu, za častého míchání. Rozdělte 4 ml média do 13/100 zkumavek s vatovými uzávěry.

Sterilizujte v autoklávu při 121 ° C po dobu 15 minut. Vyjměte z autoklávu a nechte stát v úhlu tak, aby byla hluboká základna a krátké zkosení.

Uchovávejte v chladničce při 2-8 ° C. Před zasetím bakteriálního kmene jej nechte zahřát.

Barva dehydratovaného média je béžová a připravené médium je načervenale fialové.

Konečné pH připraveného média je 6,7 ± 0,2

Médium zžloutne při pH 5,2 nebo méně a je fialové při pH 6,5 a vyšším.

Aplikace

Tento test, spolu s dalšími biochemickými testy, se používá k identifikaci bacilů čeledi Enterobacteriaceae.

Médium se naočkuje přímou smyčkou nebo jehlou, jeden nebo dva vpichy se provedou na dno zkumavky a poté se povrch média vyhodnotí v klikatém stavu.

Inkubujte 24 hodin při aerobióze při 35–37 ° C. V případě potřeby se inkubuje dalších 24 hodin.

Zejména je užitečné odlišit laktobě negativní druhy Citrobacter od Salmonellas sp.

Zdroj: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. ed. Editorial Panamericana SA Argentina.

Reference

1. Mac Faddin J. (2003). Biochemické testy pro identifikaci bakterií klinického významu. 3. ed. Editorial Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey a Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
3. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
4. Britannia Laboratories. Lysinový železný agar. 2015.K dispozici na: britanialab.com
5. Laboratoře BD. BBL Lysine Iron Agar Slants. 2007. K dispozici na adrese: bd.com
6. Valtek Laboratories. Střední LIA 2009. K dispozici na: andinamedica.com