AGAR MRS: ZALOŽENÍ, PŘÍPRAVA A POUŽITÍ - BIOLOGIE - 2025

Agaru MRS je selektivní pevné kultivační médium používá pro izolaci a stanovení kyselých mléčných bakterií, zejména rodu Lactobacillus. Tento agar byl vytvořen v roce 1960 Manem, Rogosou a Sharpem, nesoucím stejné jméno, ale kvůli jeho složitosti se často používá zkratka MRS.

Skládá se z proteosového peptonu, masového extraktu, kvasnicového extraktu, glukózy, sorbitan monooleátu, fosforečnanu draselného, ​​octanu sodného, ​​citronanu amonného, ​​síranu hořečnatého, síranu manganatého a agaru.

Muž Rogosa a Sharpe Agar (MRS) naočkovaný Lactobacillus sp. Zdroj: Foto přispěly k tomuto článku autoři: Báez E, González G, Hernández G, López E, Mega M. Fotografie pořízená během šetření s názvem: Vyhodnocení bakterií mléčného kvašení a Bifidobakterií s probiotickým potenciálem v mateřském mléce a kojeneckých stolicích.

Toto složení umožňuje správný vývoj bakterií mléčného kvašení z klinických vzorků, jako jsou fekálie, vaginální výtok, orální vzorky a mateřské mléko, jakož i mléčné a masné potraviny.

V klinických laboratořích se běžně nepoužívá, protože bakterie mléčného kvašení jsou zřídka zapojeny do chorobných procesů. Avšak v oblasti mikrobiologie potravin je častější použití agaru MRS.

Na druhé straně je toto médium používáno některými výzkumnými středisky, jejichž cílem je studium bakterií mléčného kvašení.

Základ

Agar Man, Rogosa a Sharpe má poměrně složité složení. Rozdělením funkce každé z jejích složek lze vysvětlit její základy.

Proteosový pepton, masový extrakt, kvasnicový extrakt a glukóza jsou živiny, které poskytují zdroj uhlíku, dusíku, vitamínů a minerálů nezbytných pro bakteriální růst. Kromě toho je glukóza univerzálním zdrojem energie používaným ve většině kultivačních médií.

Na druhou stranu, pro podporu růstu bakterií mléčného kvašení je nezbytná přítomnost kofaktorů (kationtů) nezbytných pro metabolismus Lactobacillus a souvisejících bakterií; Tyto sloučeniny jsou sodné, horečnaté a manganové soli.

Podobně sorbitan monooleát nebo polysorbát 80 jsou důležitým zdrojem mastných kyselin, protože jsou absorbovány jako živiny.

Dále sorbitan monoleát a citronan amonný působí tím, že inhibují rozvoj doprovodné flóry, zejména gramnegativních bakterií, čímž poskytují selektivní charakter tohoto agaru.

Nakonec agar je agar, který zajišťuje pevné konzistenci média.

Existují i ​​jiné varianty agaru Man Rogosa Sharpe; jeden z nich je doplněn cysteinem (MRSc), velmi užitečným pro izolaci bifidobakterií, mimo jiné mikroorganismy. Na druhé straně existuje médium MRS doplněné neomycinem, paromomycinem, kyselinou nalidixovou a chloridem lithným, speciálně pro selektivní počítání bifidobakterií v mléčných výrobcích.

Příprava

Naváží se 68,25 gramu dehydratovaného média a rozpustí se v jednom litru destilované vody. Nechte 5 minut stát. Chcete-li se úplně rozpustit, obraťte se na zdroj tepla, často míchejte a vařte 1 až 2 minuty. Sterilizujte v autoklávu při 121 ° C po dobu 15 minut.

Při opouštění autoklávu nechte několik minut stát a distribuujte za horka ve sterilních Petriho miskách.

Nechte desky ztuhnout a převrátit, objednávejte v stojanech na talíře a chraňte až do použití. Před použitím nechte desky ohřát na pokojovou teplotu.

PH média by mělo být 6,4 ± 0,2. Některé komerční domy doporučují pH mezi 5,5 až 5,9.

Dehydratované médium je béžové barvy a připravené je tmavě jantarové.

Dehydratované médium i připravené destičky by měly být skladovány při 2-8 ° C.

Aplikace

Agarové desky MRS mohou být naočkované na povrch (vyčerpání nebo špachtle Drigalski). Může být také zaseto do hloubky. Desky by měly být inkubovány při 37 ° C v microaerophilicity (4% O ₂ a 5 až 10% CO ₂) po dobu 24 až 72 hodin.

Výsevní metoda se volí podle sledovaného účelu (izolace nebo počítání).

Charakteristika kolonií

Předpokládané kolonie Lactobacillus rostou bělavě a na tomto agaru mají mukoidní nebo krémový vzhled. Musí být následně identifikovány.

Izolace bakterií mléčného kvašení

K tomu se používá výsev povrchu. Vzorky určené k setí vyžadují předchozí postup.

V případě vzorků mateřského mléka se doporučuje odstředit 1 ml vzorku při 14 000 ot / min po dobu 10 minut, aby se odstranila mastná vrstva. 900 µl se odstraní a ve zbývajících 100 ul se sediment suspenduje a nalije na povrch agaru MRS, který by se pak měl rovnoměrně rozmístit špachtlí Drigalski.

V případě vzorků stolice se jeden (1) gram stolice zváží a homogenizuje v 9 ml 0,1% sterilní peptonové vody, což odpovídá ředění 1/10. Poté se provede sériová ředění, dokud se nedosáhne konečného zředění ^10-4.

A konečně, 100 ul 10 ^-2, 10 ^-3 a 10 ^-4 ředění byla přijata a každé ředění se naočkuje na MRS agar, distribuci rovnoměrně s Drigalski špachtlí.

Počet bakterií kyseliny mléčné

V tomto případě se výsev provádí hloubkou.

U vzorků mateřského mléka se odebere 1 ml a umístí se do sterilní kónické plastové zkumavky. Agar MRS se přidá při přibližné teplotě 40 ° C do konečného objemu 25 ml, čímž se získá homogenní směs. Následně se rovnoměrně nalije do sterilních Petriho misek a nechá se stát do polymerace.

U vzorků stolice se provádí ředění, jak bylo popsáno výše. Vezměte 1 ml každého ředění a vložte jej do sterilních kónických plastových zkumavek. Roztavený agar MRS se přidá do objemu 25 ml.

Směs každého ředění se nalije rovnoměrně do sterilních Petriho misek. Nakonec se ponechá v klidu až do polymerace.

Kolonie počítají s agarem Man Rogosa a Sharpe (MRS). Zdroj: Fotografie věnovaná na tento článek. Autoři: Báez E, González G, Hernández G, López E, Mega M. Fotografie pořízená v průběhu výzkumu s názvem: Hodnocení bakterií mléčného kvašení a bifidobakterií s probiotickým potenciálem v mateřském mléce a kojeneckých stolicích.

Úroveň výzkumu

Každý den získává větší zájem studium bakterií mléčného kvašení; Výzkumní pracovníci se snaží mimo jiné dozvědět o nových kmenech a jejich potenciálu jako startovacích fermentů pro standardizaci při výrobě mléčných výrobků.

V tomto smyslu Alvarado a kol. (2007) použili MRS agar k provedení studie, ve které izolovali, identifikovali a charakterizovali bakterie kyseliny mléčné přítomné v řemeslném andeanském uzeném venezuelském sýru.

V sýru našli přítomnost bakterií rodů Lactococcus a Lactobacillus a dospěli k závěru, že směsi izolovaných kmenů jsou vhodné jako startovací kmeny při výrobě sýrů z pasterizovaného mléka.

Na druhou stranu Sánchez et al. (2017) použili MRS agar ke zkoumání přítomnosti bakterií mléčného kvašení v zažívacím traktu selat, aby je mohli použít jako nativní probiotika, která zvyšují produktivitu zdravých selat.

S tímto médiem se jim podařilo izolovat čtyři druhy: Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus brevis, Enterococcus hirae a Pediococcus pentosaceus.

Podobně Báez et al. (2019) použili MRS agar k vyhodnocení bakterií mléčného kvašení (LAB) a bifidobakterií s probiotickým potenciálem v mateřském mléce a kojeneckých stolicích.

Podařilo se jim izolovat 11 BAL a 3 Bifidobacteria sp do mateřského mléka a 8 BAL a 2 Bifidobacteria sp. ve výkalech. Všichni splnili určité parametry, které je prokazují jako bakterie s probiotickou aktivitou.

Autoři došli k závěru, že jak mateřské mléko, tak stolice výlučně kojených dětí slouží jako přírodní zdroje probiotických bakterií.

QA

Pro vyhodnocení kvality agaru MRS kontrolujte kmeny, jako například:

Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Lactobacillus casei ATCC 393, Bifidobacterium bifidum ATCC 11863, Lactobacillus plantarum MKTA 8014, Lactobacillus lactis MKTA 19435, Pediococcus damnosus MKTA 29358, Escherichia coli a Bacillus ci.

Očekávané výsledky jsou uspokojivým růstem pro prvních 6 bakterií, zatímco E. coli a Bacillus cereus musí být zcela inhibovány.

Reference

1. Alvarado C, Chacón Z, Otoniel J, Guerrero B, López G. Izolace, identifikace a charakterizace bakterií mléčného kvašení venezuelského uzeného andského řemeslníka. Jeho použití jako kultura startéru. Cient. (Maracaibo) 2007; 17 (3): 301-308. K dispozici na adrese: scielo.org.
2. Sánchez H, Fabián F, Ochoa G, Izolace bakterií mléčného kvašení z trávicího traktu selat. Rev. vet. Peru 2017; 28 (3): 730-736. K dispozici na adrese: scielo.org.
3. Báez E, González G, Hernández G, López E, Mega M. Hodnocení bakterií mléčného kvašení a Bifidobacteria s probiotickým potenciálem v mateřském mléce a výkaly kojenců v obci Acevedo, Miranda 2017. Bakalářská práce se kvalifikovala pro bakalářský titul v oboru Bioanalýza. University of Carabobo, Venezuela.
4. Britannia Laboratory. Agar MRS. 2015.K dispozici na: britanialab.com
5. Přispěvatelé Wikipedie. Agar MRS. Wikipedia, encyklopedie zdarma. 10. ledna 2018, 19:44 UTC. K dispozici na: wikipedia.org Přístup k 17. únoru 2019.
6. Roy D. Media pro izolaci a stanovení počtu bifidobakterií v mléčných výrobcích. Int J Food Microbiol, 200128; 69 (3): 167-82.