AGAR BRAMBOROVÝ DEXTRÓZA: ODŮVODNĚNÍ, PŘÍPRAVA A POUŽITÍ - BIOLOGIE - 2025

Bramborový dextrózový agar je médium, pevný non - selektivní živné kultury. Bakteriální a houbové druhy v ní mohou růst, ale její použití je zvláště indikováno pro izolaci vláknitých hub a kvasinek. To je také známé jako PDA médium pro anglický výraz Potato Dextrose Agar.

Je zvláště užitečný pro izolaci fytopatogenních hub, tj. Těch, které ovlivňují rostliny. K zasetí vzorků z nakažené zeleniny lze použít i jiné prostředky, jako je Sabouraudův agar nebo malta-agar, avšak pro rutinní použití je výhodný agar bramborový dextróza, protože se získá větší sporulace.

Aspergillus niger a Sinemas na bramborovém dextrózovém agaru. Zdroj: Alextrevelian 006 na anglické Wikipedii / Joselrojas

Používá se také pro počítání houbových kolonií ve vzorcích kosmetiky, farmaceutických výrobků a některých mléčných potravin. Stejně tak je vhodný pro setí vzorků kožních šrotů při hledání dermatofytů, které v tomto médiu rostou velmi dobře a vyvíjejí se jejich charakteristické pigmenty.

Médium brambor dextrózy je velmi jednoduché a snadno připravitelné médium v ​​laboratoři. Obsahuje, jak již název napovídá, infúzi brambor, dextrózy a agaru. Kromě toho mohou být přidány inhibiční látky, aby se zabránilo bakteriálnímu růstu a zvýšila selektivita pro houbové druhy.

Základ

Bramborový dextrózový agar je kultivační médium, které poskytuje nutriční prvky nezbytné pro vývoj vláknitých hub a kvasinek.

Kombinace infúze brambor s glukózou poskytuje dokonalý zdroj energie pro uspokojivý růst hub. Zatímco agar je ten, kdo zajišťuje konzistenci média.

Samotné médium neinhibuje růst bakterií, proto je to neselektivní médium. Aby byl selektivní, potřebuje přidání inhibičních látek, jako je kyselina vinná nebo antibiotika.

Příprava

- Domácí (nekomerční) příprava bramborového dextrózového agaru

Petriho misky

Připravuje se takto:

Za prvé, brambory se umývají velmi dobře a odstraňují tak půdu, kterou mají. Jsou nakrájeny na tenké plátky se vším a skořápkou. 200 gramů brambor se zváží a půl hodiny vaří v litru destilované vody.

Na konci času zfiltrujte nebo přefiltrujte veškerou přípravu přes sýr.

Získaná kapalina se doplní destilovanou vodou do jednoho litru. K infuzi se přidá 20 g agar-agaru a 20 g dextrózy, dobře se promíchá a autoklávuje se při 121 ° C a tlaku 15 liber po dobu 15 minut.

Nechte vychladnout na 50 ° C a podávejte ve sterilních Petriho miskách. Připravené destičky jsou uloženy v lednici.

Klíny

Lze také připravit klíny z brambor dextrózového agaru.

V tomto případě se před sterilizací v autoklávu umístí 12 až 15 ml média do zkumavek, později se autoklávuje a při odchodu leží na speciálních nosičích, dokud neztuhne. Uchovávejte v chladničce.

Médium zůstává při pH 5,6 ± 0,2, avšak některé laboratoře přidávají 10% kyselinu vinnou ke snížení pH na 3,1 ± 0,1, aby se inhiboval bakteriální růst.

Ve stejném smyslu jiné laboratoře dávají přednost přidání antibiotik, aby byly selektivní pro pěstování plísní a zabránily růstu bakterií.

- Komerční příprava agaru bramborové dextrózy

Naváží se 39 g komerčně dostupného dehydratovaného média a rozpustí se v jednom litru destilované vody. Nechte to 5 minut odpočívat.

Směs se zahřívá za častého míchání až do úplného rozpuštění. Následně se sterilizuje v autoklávu při 121 ° C po dobu 15 minut.

Desky nebo klíny mohou být připraveny. Postupujte jak je popsáno výše.

PH zůstává na 5,6 ± 0,2. Pokud je požadováno pH 3,1, mělo by se před podáním na destičky přidat 14 ml sterilní 20% kyseliny vinné.

Surové médium je béžové a připravené médium je světle oranžové s lehce zakaleným nebo opalizujícím vzhledem.

Aplikace

Způsob setí rostlinných vzorků na agaru bramborové dextrózy

-Pro zabarvené listy

Listy jsou nakrájeny na kousky.

Ve sklenici 50 cm3 s 50% alkoholem vložte kousky listů (obarvené a zdravé kousky), aby dezinfikovaly povrch po dobu 20 až 30 sekund. Vyhoďte alkohol a přidejte 20% chlornan sodný po dobu 40 až 50 sekund, pokud jsou tenké listy, a zvyšte čas na 80 sekund, pokud je to kůra a polena.

Zlikvidujte chlornan sodný a dezinfikujte kousky sterilními kleštěmi a umístěte je na povrch média (maximálně 10 kusů). Nastavte datum a inkubujte při 20 - 30 ° C.

-Pro ovoce a hlízy

Pokud je ovoce masité, otevřete ovoce napadené houbou a rozdělte kousky sterilním skalpelem z postižených i zdravých částí a položte je na povrch agaru.

Je-li ovoce citrusové, jako je citron nebo pomeranč, musí být otevřeno a jeho semena zasetá.

Když je ovlivněn povrch ovoce a jsou pozorovány spory, je ideální použít metodu strouhání na talíři; To spočívá v tom, že se spory dotkly sterilizovanou a chlazenou špachtlí ve tvaru písmene „L“ a potom se na agaru 2 až 3krát naočkovalo klikatá semena.

-Pro zrna

Dezinfikují se, jak je popsáno v listech, a později se umístí na agar.

-Pro větve a stonky

Kůra se oškrábe a později se kousky zdravé a nemocné části odeberou a vysejí přímo na agar.

Očkované destičky se inkubují aerobně při 20-30 ° C po dobu 72 hodin.

Postup pro setí vzorků kůže, vlasů nebo nehtů na agaru bramborové dextrózy

Odběr vzorků by měl být prováděn pomocí čepele skalpelu č. 11, a to buď pro oříznutí postižených vlasů, kožních šupin nebo nehtů při hledání dermatofytů. Před odebráním vzorku je třeba oblast dezinfikovat 70% alkoholem.

-Skin vzorek

U šupinatých lézí by měl být okraj léze seškrábán, protože se zde pravděpodobně vyskytuje houba.

U exsudativních lézí se vzorek odebere suchým nebo mokrým tamponem. Okamžitě zasejte na bramborový dextrózový agar nebo agar Sabouraud. Vyhněte se dopravním prostředkům.

Další metodou vzorkování je technika kobercových čtverců Mariat a Adan Campos. V tomto případě je postižená oblast 5krát třena kouskem sterilní vlny pro následnou kultivaci.

Vzorek může být umístěn přímo do kultivačního média.

-Velký vzorek

V závislosti na patologii může být postižená část odříznuta nebo vykořeněna. Umístěte vzorek do kultivačního média.

-Nail vzorek

Konkrétní část postiženého nehtu může být seškrábnuta nebo oříznuta. Bude záležet na typu zranění.

Před výsevem rozřízněte vzorek na kousky 1 mm, aby se zvýšila pravděpodobnost kontaktu houby s kultivačním médiem.

Postup identifikace

Kolonie získané v destičce se izolují ve zkumavkách obsahujících bramborový dextrózový agar, odtud se provádí makroskopická studie kolonií (vzhled, barva, konzistence, stupeň vývoje).

Mikroskopická studie (pozorování struktur a jejich formování) může být prováděna mikrokulturami nebo přímým pozorováním pod mikroskopem mezi sklíčko a sklíčko.

Počet kolonií

Toto médium lze také použít ke stanovení plísňové a kvasnicové zátěže přítomné ve vzorcích rostlin, potravin, kosmetických přípravků nebo léčiv. K tomuto účelu se používá bramborový dextrózový agar doplněný antibiotiky, jako například: (chloramfenikol, chlortretracyklin nebo obojí).

Nalijte 1 ml vzorku - nejlépe zředěný - do sterilní a prázdné Petriho misky, poté roztavte polštářek bramborového dextrózového agaru a nechte vychladnout na 45 ° C. Nalijte na Petriho misku a otáčejte, dokud se homogenizuje. Nechte ji odpočívat, dokud neztuhne.

Inkubujte aerobně při 20-25 ° C (plísně) nebo 30-32 ° C (kvasinky) po dobu 5 až 7 dnů nebo déle, v závislosti na typu hledané houby a typu vzorku. Pro inkubaci v obou teplotních rozsazích lze použít dvě plotny.

Počítání houbových kolonií ve vzorku potravy. Agar bramborový dextróza doplněný antibiotiky. Zdroj: Pxhere.com photo / 777267

Údržba plísňových kmenů

Bramborový dextrózový agar lze použít k udržení životaschopných kmenů hub po dobu několika let.

Za tímto účelem se houba pěstuje na klínech bramborového dextrózového agaru a jakmile houba roste, pokryje se minerálním olejem. Olej by měl být sterilizován v autoklávu po dobu 45 minut a měl by mít viskozitu přibližně 300 až 330 Saybolt. Olej by měl být 1 až 2 cm nad špičkou zkosení.

QA

Z každé připravené šarže vezměte 1 nebo 2 destičky a inkubujte je při 25 ° C po dobu 48 hodin nebo při 20 ° C po dobu 96 hodin. Dobrá kontrola sterility je taková, u které není pozorován vývoj kolonií.

Lze použít také známé nebo certifikované kontrolní kmeny, jako například:

Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763, Candida albicans ATCC 10231, Aspergillus brasiliensis ATCC 16404, Trichophyton mentagrophytes ATCC 9533. Ve všech případech se očekává dobrý růst.

Reference

1. Britannia Laboratories. Glukózový agar brambory. 2015.K dispozici na: britanialab.com
2. Neogen Laboratories. Agar bramborový dextróza. K dispozici na adrese: foodsafety.neogen.com
3. Insumolabova laboratoř. Bramborový dextrózový agar. K dispozici na adrese: insumolab.cl
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey a Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
5. Casas-Rincón G. Obecná mykologie. 1994. 2. ed. Central University of Venezuela, Library Editions. Venezuela Caracas.
6. Aceituno M. Hodnocení mikrobiologické kvality v očním stínu, kompaktní typ prášku národní produkční laboratoře, podle referenční metody Pharmacopea Usp 2005. Diplomová práce pro získání titulu farmaceutický chemik. Univerzita v San Carlos v Guatemale.
7. Cuétara M. Zpracování povrchových vzorků. Iberoamerican Journal of Mycology. 2007; str. 1-12