SABOURAUDŮV AGAR: ZALOŽENÍ, PŘÍPRAVA A POUŽITÍ - BIOLOGIE - 2025

Agaru Sabouraud, také známý jako Sabouraud dextrózový agar, je pevný prostředek, zejména obohacené pro izolaci a rozvoj plísní, jako jsou například kvasinky, plísně a dermatofyty.

Proto toto médium nemůže chybět v mikrobiologické laboratoři pro zkoumání přítomnosti patogenních nebo oportunních hub z klinických nebo neklinických vzorků. Rovněž je ideální pro růst vláknitých bakterií, jako jsou Streptomyces a Nocardias. Jeho použití je velmi široké, protože může být použito v lidské, živočišné, rostlinné a průmyslové mykologii.

A. Neviděný Sabouraudův agar. Agar B. Sabouraud naočkovaný kvasinkami. Zdroj: Fotografie pořízené autorem MSc. Marielsa gil

Toto médium bylo vytvořeno v roce 1896 předním dermatologem Raimondem Sabouraudem, který se stal světově uznávaným specialistou na poruchy pokožky hlavy, způsobené hlavně dermatofyty.

Jeho tvorba byla tak důležitá, že se používá dodnes a zůstává dodnes, i když s určitými úpravami.

Ačkoli to je zvláštní pro houby, bakterie mohou růst v tomto médiu, a proto u vzorků se smíšenou flórou je pro zahrnutí bakterií do jejich přípravy nutné, aby se inhiboval růst bakteriální flóry, která může být přítomna.

Výběr antibiotika musí být proveden pečlivě as ohledem na typ houby, která má být získána, protože některé jsou inhibovány v přítomnosti určitých látek.

Základ

Agar Sabouraud dextrózy je médium, které je ve své původní formulaci slabě selektivní, vzhledem k jeho kyselému pH 5,6 ± 0,2, ale bakterie se mohou stále vyvíjet, zejména při dlouhodobých inkubacích.

Médium obsahuje kaseinový pepton a pankreatický výtěžek živočišné tkáně, které poskytují zdroj uhlíku a dusíku pro růst mikroorganismů.

Obsahuje také vysokou koncentraci glukózy, která působí jako zdroj energie a podporuje růst plísní nad bakteriemi. To vše ve směsi s agarem, složkou, která mu dává správnou konzistenci.

Na druhé straně agar Sabouraud dextrózy může být selektivní, pokud se přidají antibiotika.

U antibiotik je to zvláště užitečné ve vzorcích ran, otevřených vředů nebo jakéhokoli vzorku, u kterého existuje podezření na velkou bakteriální kontaminaci.

Nejčastěji používané kombinace agaru Sabouraud dextrózy s antibiotiky

-Saburaudův agar s chloramfenikolem: ideální pro regeneraci kvasinek a vláknitých hub.

- Sabouraudův agar s gentamicinem a chloramfenikolem: v tomto médiu rostou téměř všechny vláknité houby a kvasinky a inhibuje velké množství bakterií, včetně Enterobacteriaceae, Pseudomonas a Staphylococcus.

- Sabouraudův agar s cykloheximidem: je zvláště užitečný pro vzorky z kůže nebo dýchacích cest, pokud je podezření dimorfní houby.

Cykloheximid by měl být používán s opatrností; Ačkoli se používá k inhibici růstu nepatogenních nebo environmentálních hub a kvasinek, které mohou být přítomny jako kontaminanty ve vzorku, také inhibuje růst některých hub, jako jsou Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Allescheria boydii, Penicillium sp a další oportunistické houby.

- Sabouraudův agar s chloramfenikolem a cykloheximidem: používá se hlavně k izolaci dermatofytů a dimorfních hub. Nevýhodou je, že inhibuje některé druhy oportunních hub, jako jsou Candida no albicans, Aspergillus, Zygomycetes nebo C. neoformans.

- Sabouraudův agar s chloramfenikolem, streptomycinem, penicilinem G a cykloheximidem: je ideální pro vzorky extrémně kontaminované bakteriemi a saprofytickými houbami, má však nevýhodu v tom, že inhibuje růst Actinomyces a Nocardias, kromě výše uvedených oportunistických hub.

Příprava

Pokud máte ingredience samostatně, lze je připravit následujícím způsobem:

Sabouraud dextrózový agar

Vážit:

- 40 g dextrózy

- 10 g peptonu

- 15 g agar-agaru

- Změřte 1000 ml destilované vody

Všechny složky jsou smíchány, pH je upraveno na 5,6. Rozpuštěné látky se rozpustí vařením, 20 ml média se rozdělí do zkumavek o rozměrech 25 x 150 mm, bez okraje a s výhodou s vatovým uzávěrem.

Trubky s vatovým uzávěrem. Zdroj: Fotografie pořízená autorem MSc. Marielsa gil

V závislosti na dostupnosti lze také použít jiné velikosti zkumavek.

Jsou autoklávovány po dobu 10 minut při tlakové atmosféře (121 ° C). Neměla by být překročena doba autoklávování. Při opouštění autoklávu jsou trubky nakloněny pomocí držáku, dokud neztuhnou v zobáku na flétnu.

Dalším způsobem je rozpustit ingredience zahříváním, dokud se nevarí. Autoklávujte 10 minut ve stejné lahvičce a poté rozdělte 20 ml do Petriho misek.

Pokud máte agarové médium Sabouraud dextrózy, které již obsahuje všechny ingredience, pokračujte v zvážení množství specifikovaného komerční společností na jeden litr vody. Zbytek kroků je stejný jako výše popsané kroky.

Sabouraudův dextrózový agar (Emmonsova modifikace)

Vážit:

- 20 g dextrózy

- 10 g peptonu

- 17 g agar-agaru

- Změřte 1000 ml destilované vody

Všechny složky jsou smíchány, pH je upraveno na 6,9. Postupujte stejným způsobem jako v předchozím případě.

Existují komerční domy, které nabízejí médium se všemi ingrediencemi. V takovém případě zvažte a připravte postup popsaný na příbalové informaci.

Sabouraudův dextrózový agar (Emmonsova modifikace) s chloramfenikolem

Zásobní roztok chloramfenikolu

- Odvážte 500 mg báze chloramfenikolu

- Změřte 100 ml 95% ethanolu

- Mix

Médium s agarem Sabouraud dextrózy (Emmons) se připraví jak bylo popsáno výše a navíc se pro každý litr média přidá před autoklávováním 10 ml zásobního roztoku chloramfenikolu.

Sabouraud Emmons Dextrose Agar s cykloheximidem

Zásobní roztok cykloheximidu

- Naváží se 5 g cykloheximidu

- Změřte 100 ml acetonu

- Mix

Médium s agarem Sabouraud dextrózy (Emmons) se připraví, jak již bylo popsáno, a navíc se pro každý litr média přidá 10 ml zásobního roztoku cykloheximidu před autoklávováním.

Sabouraud dextrózový agar (Emmons) s chloramfenikolem a cykloheximidem

Médium s agarem Sabouraud dextrózy (Emmons) se připraví jak bylo popsáno výše a navíc se pro každý litr média přidá před autoklávováním 10 ml zásobního roztoku chloramfenikolu a 10 ml zásobního roztoku cykloheximidu.

Další antibiotika, která lze přidat

20 000 až 60 000 jednotek penicilinu na litr média.

30 mg streptomycinu na litr média.

Oba musí být začleněny po autoklávování média, mírně ochlazené (50-55 ° C).

0,04 g neomycinu na litr média.

0,04 g gentamicinu na litr média.

Zvláštní úvahy

Z důvodu bezpečnosti je výhodné raději zasévat agar Sabouraud dextrózy do klínovitých zkumavek (nakloněných v zobáku z flétny) než do Petriho misek, aby se zabránilo rozptylu a inhalaci spór.

Je důležité, aby zkumavky s agarem Sabouraud byly pokryty vatou a nikoliv šroubovacím uzávěrem, protože u některých kmenů, například u Coccidioides immitis, bylo prokázáno, že částečně anaerobní podmínky inhibují tvorbu spór. Také většina hub je aerobní.

V případě použití šroubovacího uzávěru nezavírejte hermeticky.

QA

Připravená média se musí podrobit kontrole kvality, aby se ověřilo její správné fungování. Za tímto účelem se vysévají určité kontrolní kmeny.

Pro agar Sabouraud dextrózy s chloramfenikolem lze použít kmeny ATCC z Candida albicans, které musí mít vynikající růst. Další destička se naočkuje kmeny Escherichia coli, které musí být zcela inhibovány.

Inkubuje se také neinokulovaná destička, ve které by neměly růst žádné mikroorganismy.

Kmeny Trichophyton mentagrophytes mohou být použity pro agar Sabouraud dextrózy s chloramfenikolem a cykloheximidem a měly by se dobře vyvíjet. Další plotna je naočkována kmenem Aspergillus flavus, ve kterém musí být malý nebo žádný růst. Kromě toho se neinokulovaná destička inkubuje, aby se prokázala její sterilita.

Pro agar Sabouraud dextrózy s cykloheximidem se používají kmeny Candida albicans, Trichophyton rubrum nebo Microsporum canis, které musí vykazovat dobrý růst.

Podobně je zahrnut kmen Aspergillus flavus, který vykazuje malý nebo žádný růst. Nakonec inkubujte neinokulovanou destičku pro kontrolu sterility.

Aplikace

Primární kultura

Klasický agar Sabouraud dextrózy obsahuje 4 gramy dextrózy a je vynikající jako primární izolační médium, protože ukazuje charakteristickou morfologii každé houby.

Je také vynikající pro demonstraci produkce pigmentu. Není to však nejlepší způsob pozorování sporulace.

Nedoporučuje se také pro kultivaci Blastomyces dermatitidis, která je inhibována vysokou koncentrací přítomné glukózy.

Na druhou stranu pro kultivaci je třeba vzít v úvahu určité úvahy.

Některé houby rostou nejlépe při pokojové teplotě, jako jsou plísně, jiné rostou úspěšně při 37 ° C, jako jsou některé kvasinky, a jiné mohou růst při obou teplotách (dimorfní houby).

Z tohoto důvodu je někdy nutné použít několik agarových destiček Sabouraud pro tentýž vzorek, protože dvojité očkování se často provádí k inkubaci jedné destičky při pokojové teplotě a další při 37 ° C.

Například Sporothrix schenckii je zaseta do dvou desek; jedna se inkubuje při teplotě místnosti, aby se získala fáze formy, a druhá se inkubuje při 37 ° C, aby se získala fáze kvasinek, ale v druhé se musí do média přidat 5% krve.

V jiných případech, jako jsou vzorky mycetomu, se naočkují dvě misky s agarem Sabouraud, jedna s chloramfenikolem a druhá s cykloheximidem. První umožní růst myktomových původců plísní (Eumycetoma) a druhých původců mycetomu bakteriálního původu, jako jsou aktinomycetomy.

Sporulace

Emmons Modified Sabouraud Dextrose Agar obsahuje 2 gramy dextrózy a používá se nejen k izolaci, ale také ke sporulaci a konzervaci hub.

V tomto médiu mohou být získány kmeny Blastomyces dermatitidis.

Zachování

Aby se zachovaly houby, mohou být uchovávány v lednici (2-8 ° C). Doba uchovávání se může lišit od 2 do 8 týdnů. Po uplynutí této doby musí být subkultivováni, aby se proces opakoval.

Některé houby se nejlépe udržují při pokojové teplotě, jako je Epidermophyton foccosum, Trichophyton schoenleinnii, T. violaceum a Microsporum audounii.

Udržování kmene může být prodlouženo, aby se zabránilo pleomorfismu, pokud je dextróza zcela odstraněna z agaru a pokud je množství agaru v médiu sníženo, aby se zabránilo suchosti.

Mikrokultury

Pro identifikaci některých vláknitých hub je nutné provést mikrokultury pomocí Sabouraudova agaru nebo jinými speciálními prostředky, aby se sledovaly struktury sexuální a asexuální reprodukce.

V lidské mykologii

Používá se hlavně pro diagnostiku plísňových chorob, zejména těch, které ovlivňují kůži a její připevnění (vlasy a nehty).

Vzorky mohou být sekrece, exsudáty, kůže, vlasy, nehty, sputum, CSF nebo moč. Běžně izolované patogeny jsou dermatofyty, houby, které způsobují subkutánní a systémové mykózy.

Mykologie zvířat

Zvířata jsou často ovlivněna plísňovými infekcemi, a proto je agar Sabouraud v mykologii zvířat stejně užitečný jako u lidí.

Například dermatofyty mohou často ovlivňovat zvířata. To je případ Microsporum canis var distortum, který často infikuje psy, kočky, koně, prasata a opice. Stejně tak Microsporum gypseum infikuje psy, kočky a hospodářská zvířata.

Ptáci, jako jsou kuřata, kohouti a kuřata, jsou zasaženi mikroorganizmy Microsporum gallinae.

Jiné houby, jako je Zymonema farciminosum, jsou také příčinou onemocnění u zvířat, zejména u koní, mezků a oslů, a způsobují významný zánět v lymfatických cévách.

Sporothrix schenkii a Histoplasma capsulatum ovlivňují domácí zvířata a lidi.

Environmentální mykologie

Mnoho patogenních nebo oportunních plísní se může soustředit kdykoli v daném prostředí, zejména v operačních sálech a jednotkách intenzivní péče (ICU) klinik a nemocnic. Proto je nutné je kontrolovat.

Dalšími zranitelnými prostory jsou knihovny a staré budovy, které mohou být ovlivněny koncentrací ekologických hub.

V environmentálních studiích se agar Sabouraud dextrózy používá k izolaci hub.

Průmyslová mykologie

Agar Sabouraud dextrózy nemůže chybět mimo jiné pro studium kontaminujících hub ve výrobě kosmetiky, potravin, nápojů, kůže, textilu.

Mykologie rostlin

Rostliny také trpí chorobami způsobenými houbami, které postihují různé části rostliny, které mohou dokonce sklizeň ukončit, což způsobuje velké ztráty v zemědělství.

Reference

1. Cuenca M, Gadea I, Martín E, Pemán J, Pontón J, Rodríguez (2006). Mikrobiologická diagnostika mykóz a antimykotické studie. Doporučení Španělské společnosti pro infekční choroby a klinickou mikrobiologii. K dispozici na adrese: coesant-seimc.org
2. ValteK Laboratory. (2009). Sabouraud dextrózový agar s cykloheximidem. K dispozici na adrese: andinamedica.com.
3. Navarro O. (2013). Veterinární mykologie. Národní agrární univerzita. Nikaragua.
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Argentina. Editorial Panamericana SA
5. Casas-Rincón G. Obecná mykologie. 1994. 2. ed. Central University of Venezuela, Library Editions. Venezuela Caracas.