Agar TCBS je prostředkem vysoce selektivní a diferenciální pevné kultury, které se používají pro izolaci a kultivaci bakterií rodu Vibrio, zejména Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus a V. vulnificus jako hlavní původci tohoto druhu.
Zkratka TCBS je zkratkou pro thiosulfát citrátovou žlučovou sacharózu. Tento agar je také známý jako selektivní médium pro Vibrios. Původní recept byl vytvořen Nakanishim a později modifikován Kobayashim.
Komerční TCBS médium a TCBS agarová deska naočkovaná Vibrio cholerae. Zdroj: foto 1: pořízeno autorem MSc. Marielsa Gil / Foto 2: Microrao, JJMMC, Davangere, Karnataka, Indie
Skládá se z kvasničného extraktu, masného peptonu, tripteinu, citranu sodného, thiosíranu sodného, oxímu žluči, sacharózy, chloridu sodného, citronanu železitého, bromtymolové modři, thymolové modři a agaru.
Toto složení umožňuje přiměřený vývoj druhů Vibrio ze vzorků vody, potravy a stolice; s výjimkou Vibrio hollisae, který na tomto médiu neroste. Kromě toho je médium TCBS schopné inhibovat růst dalších doprovodných bakterií, zejména koliformních organismů.
Vzhledem k závažným gastrointestinálním a mimostřevním problémům způsobeným některými druhy rodu Vibrio je její diagnostika velmi důležitá. Lidé jsou infikováni hlavně tím, že jedí syrové nebo nedostatečně vařené potraviny z moře nebo znečištěných vod, ale také infekcí ran.
Z tohoto důvodu musí klinické laboratoře zahrnovat agendu TCBS ve studii kultivace stolice kapalných vzorků stolice, zejména s výskytem rýžové vody. Zejména pokud pacient hlásí, že byl v kontaktu s mořskou vodou nebo že konzumoval měkkýše nebo ryby.
Základ
Výtažky z kvasinek, masové peptony a triptein jsou zdrojem výživy tohoto média. Agar TCBS je však pro většinu bakterií nehostinné médium.
Jeho vysoká selektivita je dána přídavkem citranu sodného a žlučí; obě jsou inhibičními činidly, která také poskytují médiu alkalické pH, omezují růst doprovodné flóry a podporují růst V. cholerae, mezi jinými druhy. Je třeba poznamenat, že Vibrio cholerae je velmi citlivý na kyselost.
Chlorid sodný osmoticky vyrovnává médium. Navíc, protože jeho koncentrace je vysoká, působí také jako inhibiční činidlo, podporující růst halofilních bakterií.
Sacharóza je fermentovatelný cukr, který společně s indikátory pH bromtymolové modře a thymolové modři dávají médiu jeho odlišný charakter. Z tohoto důvodu je možné tímto médiem odlišit kmeny fermentující sacharózu od kmenů, které nekvasily.
Kolonie kmenů fermentujících sacharózu se zbarvují žlutě a díky produkci kyseliny změní médium ze zelené na žlutou. Nefermentanty rostou průsvitně a médium zůstává původní barvou (zelená).
Stejně tak toto médium obsahuje thiosíran sodný jako zdroj síry a citrát železitý jako vyvíjející činidlo. Oba vykazují bakterie schopné produkovat sirovodík (bezbarvý plyn). H 2 S je vytvořen z thiosulfát a následně po reakci s citrátem železitým viditelným černá sraženina.
Nakonec agar poskytuje pevné konzistenci média.
Příprava
Naváží se 89 g dehydratovaného média a rozpustí se v jednom litru destilované vody. Pomozte rozpuštění zahřátím a častým mícháním. Směs lze vařit až 2 minuty.
Toto médium není autoklávováno. Po rozpuštění se podává přímo na sterilních destičkách. Když ztuhnou, jsou uspořádány obráceně na destičkách a až do použití jsou uchovávány v lednici (2-8 ° C).
Médium po přípravě musí zůstat při pH 8,6 ± 0,2.
Barva dehydratovaného média je světle béžová nebo zelenkavě béžová a barva média je zelená nebo modrozelená.
Před naočkováním vzorků je důležité nechat desky zahřát se.
Použití
Nejběžnějším vzorkem izolace Vibrios je průjmová stolice.
Vzorky stolice, pokud nemohou být okamžitě naočkovány na selektivní médium, by měly být přepravovány na médiu Cary Blair.
Pro zvýšení citlivosti kultury mohou být výkaly propuštěny peptonovou vodou při pH 8,4 jako obohacovací médium po dobu maximálně 8 hodin, odtud jsou subkultivovány do média TCBS.
Je také třeba vzít v úvahu, že některé kmeny Vibrios mohou u pacientů s imunosupresí vyvolat septikémii, a proto je lze izolovat z krevních kultur. Podobně lze analyzovat vzorky vody a jídla z moře, pokud dojde k epidemii ohniska cholery.
Zaseté
Inokulum studovaného vzorku musí být prominentní, setí se provádí pomocí pruhovací metody vyčerpáním. Destičky se inkubují při 37 ° C po dobu 24 hodin v aerobióze.
Předpokládané kolonie Vibrio cholerae jsou středně velké, hladké, neprůhledné, s tenkými okraji a žluté barvy díky fermentaci sacharózy.
Druh V. alginolyticus, V. fluvialis, V. hareyi, V. cincinnatiensis, V. furnissii, V. metschnikovii a některé V. vulnificus rostou podobným způsobem. Jiné klinicky důležité druhy Vibrios, jako je V. parahaemolyticus, nekvasí sacharózu a vyvíjejí se jako olivově zelené kolonie.
Deska agaru TCBS naočkovaná Vibrio parahaemolyticus. Zdroj: isis325 Flickr
Na druhou stranu je třeba mít na paměti, že některé kmeny Aeromonas a Plesiomonas, které jsou oxidázou (+), mohou růst v tomto médiu a vyvíjet žluté kolonie, které mohou lékaře zmást. Zatímco některé kmeny Pseudomonas také oxidáza (+) rostou jako zelené kolonie jako V. parahaemolyticus.
Omezení
Test oxidázy, který je pozitivní pro rod Vibrio, by se nikdy neměl provádět z kolonií získaných z TCBS agaru, protože získaný výsledek bude falešně negativní. Sloučeniny ve středu silně narušují tento test. Proto musí být vyrobena ze subkultur na krevním agaru.
QA
Aby se prokázalo, že médium je v dobrém stavu, je vhodné osít známé nebo certifikované kontrolní kmeny a sledovat, zda růst splňuje očekávané charakteristiky.
K tomu můžete použít kmeny:
-Vibrio cholerae - uspokojivý růst (žluté kolonie, průsvitný okraj).
-Vibrio parahaemolyticus - - uspokojivý růst (kolonie se zeleným středem a průsvitnou hranicí).
-Vibrio alginolyticus ATCC 17749 - uspokojivý růst (žluté kolonie s halos stejné barvy kolem kolonie).
-Enterococcus faecalis ATCC 29212 - celková nebo částečná inhibice (malé žluté nebo průsvitné kolonie).
-Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853-– částečná nebo úplná inhibice (modré kolonie).
-Escherichia coli ATCC 25922 - Zcela inhibováno.
-Proteus mirabilis ATCC 43071 -– Celková nebo částečná inhibice. (Malé kolonie zelené centrum průsvitné hranice).
Inkubace nezaočkovaného média by měla být nezměněna.
Reference
- Difco Francisco Soria Melguizo Laboratories. Agar TCBS. 2009. K dispozici na adrese: f-soria.es
- Laboratoř BD. BD. TCBS Agar 2003. Dostupný na: bd.com
- Britannia Laboratories. TCBS Střední. 2015.K dispozici na: britanialab.com
- Acumedia Laboratories. Agar TCBS. 2016. K dispozici na adrese: foodsafety.neogen.com
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey a Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
- Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. ed. Editorial Panamericana SA Argentina.