THAYERŮV MARTINOVÝ AGAR: ZALOŽENÍ, PŘÍPRAVA A POUŽITÍ - BIOLOGIE - 2025

Agar Thayer Martin je vysoce výživné a pevný selektivní médium pro izolaci Neisseria meningitidis a Neisseria gonorrhoeae; obě známé jako patogenní nebo klinicky důležité Neisserias.

Jednou z nejdůležitějších zvláštností Thayer Martin Agar je vysoký obsah doplňků stravy. Tato vlastnost je nezbytná, protože Neisserias jsou z nutričního hlediska velmi náročné mikroorganismy, a proto nerostou v běžných médiích.

Thayer Martin / Agar Obchodní médium Thayer Martin. Zdrojový obrázek 1: Převzato autorem MSc. Marielsa Gil, obrázek 2. Bakterie Pixinio.com kolonizované, upravené, Thayer, Martin, agar.

Na druhé straně, protože tyto mikroorganismy se obvykle nacházejí v nesterilních oblastech, je přidání inhibitorů nezbytné k zabránění růstu doprovodné flóry, aniž by to ovlivnilo vývoj rodu Neisseria.

Tento agar se skládá z GC základního agaru, hemoglobinu, doplňků výživy a komplexu inhibičních látek (antibiotika a antimykotika). Komerční domy prodávají každý z doplňků samostatně.

Vzorek pro setí v tomto médiu bude záviset na hledaném mikroorganismu. Pro Neisseria gonorrhoeae jsou ideální vzorky vaginální a uretrální sekrece. Zatímco u Neisseria meningitidis jsou nejpoužívanějšími vzorky exsudáty mozkomíšního moku, hltanu a nosohltanu.

Základ

Neisserias jsou mikroorganismy klasifikované jako nepříjemné, a proto je jejich izolace obtížná. Proto je Thayer Martín složité médium a každá z jeho složek plní funkci, která je vysvětlena níže:

GC základní agar

GC agar obsahuje proteosový pepton, kukuřičný škrob, chlorid sodný, fosforečnan draselný, fosforečnan monodraselný a agar. Její složky poskytují základní živiny pro mikrobiální vývoj, neutralizují toxické mastné kyseliny, pomáhají udržovat osmotickou rovnováhu, definují pH a poskytují pevné konzistenci médiu.

Hemoglobin

Hemoglobin poskytuje faktory V a X (nikotinamid adenin dinukleotid NAD a hemin). Z tohoto důvodu také v tomto médiu rostou druhy Haemophilus. Hemoglobin může být získán komerčně v dehydrované formě nebo může být do média přidána čerstvá defibrinovaná hovězí krev.

Obohacovací doplněk

Na druhé straně je třeba do média Thayer-Martin přidat také obohacovací doplněk, protože živiny obsažené v základním agaru nepostačují pro požadavky rodu Neisseria.

Nejčastěji používaným doplňkem pro obohacování se nazývá isovitalex. Obsahuje glutamin, adenin, NAD, kokarboxylázu, guanin, dusičnan železitý, p-aminobenzoovou kyselinu, vitamin B12, thiamin a glukózu. Všechny tyto sloučeniny jsou nezbytné pro správný vývoj patogenních Neisserias.

Inhibitory

Protože se jedná o vysoce výživné médium, musí být použity inhibitory, které zabraňují růstu mikroorganismů z obvyklé flóry oblasti, a tím podporují izolaci rodu Neisseria.

Inhibiční komplex se skládá z vankomycinu, colistinu a nystatinu. Vankomycin inhibuje růst grampozitivních bakterií, kolistin zabraňuje růstu gramnegativních bakterií, jako jsou Pseudomonas a některé saprofytické Neisserias, a nystatin působí na kvasinky, jako je Candida albicans.

Thayer Martin Agar byl později upraven; změny spočívaly v přidání trimethoprimu, zvýšení množství agaru a přidání další glukózy. Tyto změny významně zlepšily regeneraci druhů Neisseria gonorrhoeae.

Je třeba poznamenat, že trimethoprim inhibuje růst rodu Proteus a jeho následnou rojovou formaci. V tomto smyslu jsou to antibiotika, která poskytují selektivní charakter média Thayer Martin.

Příprava

Originální agar Thayer Martin

-GC agar

Naváží se 8,2 g dehydratovaného GC média a suspenduje se ve 100 ml. Promíchejte a vařte 1 minutu za častého míchání, aby se úplně rozpustil. Směs se sterilizuje v autoklávu při 121 ° C po dobu 15 minut.

- 2% hemoglobinu

2 g dehydratovaného hemoglobinu se suspendují ve 2 nebo 3 ml horké destilované vody, dokud nevznikne stejnoměrná směs. Přidá se postupně voda po doplnění objemu 100 ml. Před sterilizací musí být suspenze homogenní.

Sterilizujte v autoklávu po dobu 15 minut.

- obohacení

Rekonstituujte obchodní injekční lahvičku s ředidlem poskytnutým stejnou obchodní společností. Dobře promíchejte. Množství ředidla, které se má použít, bude uvedeno v pokynech k soupravě.

-VCN inhibiční doplněk (vankomycin, kolistin, nystatin)

Rekonstituujte lahvičku ředidlem poskytnutým obchodní společností. Dobře promíchejte. Množství ředidla, které se má použít, bude uvedeno v pokynech k soupravě.

-Připravený

Pro každých 100 ml GC agaru postupujte následovně:

Když GC agar opouští autokláv, nechte jej vychladnout na teplotu přibližně 50 ° C a přidejte 2 ml připraveného roztoku hemoglobinu, 2 ml obohaceného doplňku (isobitalex nebo britalex) a 2 ml inhibičního doplňku. Smíchejte a podávejte ve sterilních Petriho miskách.

Nechejte ztuhnout a skladujte v lednici až do použití.

Barva připraveného média je třešňově červená. Konečné pH média je 7,2 ± 0,2

Upravený agar Thayer Martin

Naváží se 8,2 g dehydratovaného GC média a suspenduje se ve 100 ml. Přidá se 1 g agar-agaru a přidá se 0,3 g glukózy. Promíchejte a vařte 1 minutu za častého míchání, aby se úplně rozpustil. Směs se sterilizuje v autoklávu při 121 ° C po dobu 15 minut.

Připravte si doplněk na hemoglobin a obohacení, jak bylo popsáno výše.

Jako supresní doplněk se používá VCNT (vankomycin, kolistin, nystatin, trimethoprim).

-Připravený

Postupujte podle popisu pro původní agar Thayer Martin.

Použití

Thayer Martin Agar by se měl nechat zahřát, než se vzorky odříznou. Obvykle používané vzorky jsou faryngeální výtěry, nazální výtěry, vaginální, uretrální a / nebo rektální výtok a CSF.

Použijte čerstvé vzorky a na agaru vytvořte silné inokulum. Vzorky se naočkují přímo vypouštěním materiálu a poté se na povrch nanese vyčerpání.

Destičky se inkubují při teplotě 35-37 ° C po dobu 24 až 48 hodin v mikroaerofilní nádobě (5% CO ₂). Na konci inkubační doby se destičky zkoumají na malé, šedé a někdy mukoidní kolonie.

Proveďte Gram a potvrzující biochemické testy na podezřelých koloniích.

QA

Následující mikrobiální kmeny mohou být použity pro kontrolu kvality Thayer Martin Agar.

Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226 a Neisseria meningitidis ATCC 13090; U obou kmenů se očekává uspokojivý vývoj.

Zahrnuty by měly být také následující kmeny: Staphylococcus epidermidis ATCC 14990, Escherichia coli ATCC 25922, Proteus mirabilis ATCC 43071 a Candida albicans ATCC 10231. U všech z nich se v tomto médiu očekává úplná nebo částečná inhibice.

Omezení

- Musíme mít na paměti, že bakterie odolné vůči použitým inhibitorům mohou růst v médiu.

- Existují kmeny Neisseria gonorrhoeae, které mohou být citlivé na použitou koncentraci vankomycinu. Z tohoto důvodu se doporučuje používat čokoládový agar doplněný isovitalexem, avšak bez inhibitorů.

- Existují kvasinkové kmeny rezistentní na nystatin, které mohou růst v tomto médiu a interferují s izolací patogenních Neisserias, zejména gonokoků.

Reference

1. Diagnostické laboratoře Valtek. Thayer-Martin Agar, 2016. K dispozici na adrese: com
2. Britannia Laboratories. Thayer Martin Střední Upraveno. 2010. K dispozici na adrese: britanialab.com
3. Přispěvatelé Wikipedie. Thayer-Martinův agar. Wikipedia, encyklopedie zdarma. 26. října 2017, 16:33 UTC. K dispozici na adrese: wikipedia.org 4. Přístup k 28. únoru 2019.
4. Britannia Laboratories. GC agar. 2010. K dispozici na adrese: britanialab.com.
5. Laboratories BBL ™ Medium Enrichment pro náročné mikroorganismy. 1999. K dispozici na adrese: bd.com
6. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey a Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.