TSI AGAR: ZDŮVODNĚNÍ, PŘÍPRAVA A POUŽITÍ - BIOLOGIE - 2025

Agar TSI nebo trojité agar cukr železo je pevné médium, které slouží jako je biochemický test vést počáteční identifikaci Gram negativní bacily. Je založena na ukázání fermentace přítomných cukrů a produkce sirovodíku a plynu.

Svým složením a základem je velmi podobný zkoušce s Kliglerovým železem, s tím rozdílem, že obsahuje pouze glukózu a laktózu. Místo toho, jak již název napovídá, obsahuje trojitý cukrový železný agar tři fermentovatelné sacharidy: glukózu, laktózu a sacharózu.

Obrázky testu TSI s různými mikroorganismy A. Escherichia coli, B. Shigella flexneri, C) Salmonella typhimurium, D. Pseudomonas aeruginosa. Zdroj: Witmadrid, z Wikimedia Commons

Kromě toho má médium TSI čtyři deriváty proteinů, které z něj činí velmi výživný agar: kvasnicový extrakt, masový extrakt, pepton a proteosový pepton. Obsahuje také síran železnatý, síran thiosíran sodný, chlorid sodný, fenolovou červeň a agar.

Neschopnost mikroorganismu fermentovat glukózu přítomnou v médiu ji okamžitě vylučuje z toho, že patří do čeledi Enterobacteriaceae. Z tohoto důvodu je tento test nezbytný při rozhodování o tom, jakou identifikační cestu je třeba použít k určení rodu a druhu.

Každá laboratoř se rozhodne, zda bude pracovat s TSI agarem nebo s železným agarem Kligler.

Základ

Každá ze sloučenin plní funkci v médiu.

Chlorid sodný a agar

Chlorid sodný je nezbytný k udržení osmotické rovnováhy média. Zatímco agar dává pevnou konzistenci.

Indikátor PH (fenolová červená)

PH připraveného média je vyváženo na 7,3 a indikátor pH (fenolová červeň) se změní na žlutý pod 6,8. To znamená, že malé množství kyselin produkovaných fermentací cukrů změní médium z červenooranžové na žluté.

Pokud k fermentaci nedojde, dojde k alkalizaci média pomocí peptonů, které se změní z červenooranžové na silně červenou.

Proteinové deriváty (kvasnicový extrakt, masový extrakt, pepton a proteosový pepton)

Když bakterie metabolizují proteiny přítomné v agaru TSI, vznikají aminy, které alkalizují médium (hlavně na úrovni zkosení), protože reakce vyžaduje kyslík. Aminy změní rámeček jasně červeně.

Ale to bude záležet na schopnosti bakterií fermentovat uhlohydráty nebo ne.

Fermentace uhlohydrátů (glukóza, laktóza a sacharóza)

Studie fermentace cukrů může poskytnout několik obrázků a každý z nich je interpretován odlišně. Interpretace testu dělí mikroorganismy do 3 kategorií: nefermentátory glukózy, nefermentátory laktózy a fermentory laktózy / sacharózy.

Je třeba poznamenat, že množství glukózy v médiu je omezené, zatímco koncentrace laktózy a sacharózy je 10krát vyšší.

Bakterie čeledi Enterobacteriaceae a další mikroorganismy fermentující glukózu začnou fermentovat tento cukr, protože je to nejjednodušší energetický uhlohydrát.

Na druhé straně laktóza a sacharóza jsou komplexní uhlohydráty, které je třeba rozložit a přeměnit na glukózu, aby mohly vstoupit do cyklu Embden-Meyerhof.

-Mikroorganismy nekvasí glukózu

Když naočkovaný mikroorganismus není schopen fermentovat glukózu, mnohem méně bude schopen fermentovat jiné uhlohydráty. Proto se zde netvoří žádné kyseliny, ale ve zkosení se pomocí peptonů vytvoří aminy.

V tomto případě se rámeček změní na silnější červenou a spodní část zkumavky může zůstat nezměněna nebo může být také alkalizována, přičemž celá zkumavka zůstane červená.

Výklad: K / K znamená alkalické zkosení / alkalické nebo neutrální dno

Na obrázku na začátku článku viz obrázek trubice D.

Tento výsledek ukazuje, že mikroorganismus nepatří do rodiny Enterobacteriaceae.

- Mikroorganismy nefermentující laktózu / sacharózu

Pokud jsou bakterie schopny fermentovat glukózu, ale ne laktózu nebo sacharózu, stane se následující:

Bakterie spotřebovávají veškerou přítomnou glukózu přibližně po 6 až 8 hodinách, budou schopny okyselit zkosení i blok; to znamená, že agar bude úplně zbarven žlutě. Když je však glukóza vyčerpaná a nelze použít laktózu a sacharózu, bakterie zahájí metabolismus bílkovin.

Tato reakce vyžaduje kyslík, proto dochází k degradaci peptonů na povrchu (zkosení). Vyráběné aminy alkalizují rámeček ze žluté na červenou. Tato reakce je prokázána po 18 až 24 hodinách inkubace.

Interpretace: K / A znamená alkalické zkosení a kyselá buchta.

Na obrázku na začátku článku viz obrázek zkumavky B.

- Mikroorganismy fermentující laktózu / sacharózu

Mikroorganismy schopné fermentovat laktózu a sacharózu mohou samozřejmě fermentovat glukózu. Po vyčerpání minimálního množství glukózy v médiu se vytvořený pyruvát začne metabolizovat za vzniku kyselin v aerobním Krebsově cyklu a v období 8 až 12 hodin bude celé médium žluté.

Pokud jsou bakterie schopny odbourávat laktózu nebo sacharózu, budou se i nadále tvořit kyseliny a po 18 až 24 hodinách bude celá zkumavka - zkosená a zátka - nadále žloutnout.

Je třeba poznamenat, že použití glukózy se provádí dvěma způsoby: jeden aerobně na úkosu zkumavky a druhý anaerobně na dně zkumavky.

Interpretace: A / A znamená kyselé zkosení / kyselé dno. Může nebo nemusí mít plyn.

Na obrázku na začátku článku viz obrázek zkumavky A.

Výroba plynu

Některé mikroorganismy jsou schopné produkovat plyn během kvašení cukrů. Plyn se v trubici prokazuje tlakem vyvíjeným v agaru. Tlak způsobuje tvorbu bublin nebo posun agaru. Někdy může tvorba plynu rozbít médium.

Je důležité, aby v době výsevu média TSI byl propíchnut čistě středem agaru, dokud nedosáhne dna. Pokud je propíchnutí odkloněno směrem ke stěnám trubice, může to vést k falešným pozitivům při výrobě plynu, protože unikne špatně vytvořeným kanálem.

Produkce plynu, stejně jako reakce, které se vyskytují v úkosu agaru, vyžadují kyslík, proto se doporučuje, aby byla zkumavka zakryta vatovou vložkou, a pokud se použije víko Bakelite, nemělo by být zcela těsné.

Produkce plynu se vykazuje jako kladná (+) nebo záporná (-).

Vzory tvorby plynu. Zdroj: Schéma vytvořená MSc. Marielsa Gil. Zdroj obrázku: VeeDunnFlickr.com/Y_tambe, přes Wikimedia Commons

Thiosíran sodný a síran železnatý amonný

Bakterie schopné produkovat sirovodík (bezbarvý plyn) absorbují síru z thiosíranu sodného přítomného v médiu. Jakmile H ₂ je vytvořen S, reaguje se síranem železnatým amonným, produkovat pyrit (jasně viditelné černé sraženiny).

H ₂ výroba S je označena jako pozitivní (+) nebo negativní (-).

Na obrázku na začátku článku viz obrázek zkumavky C.

Příprava

Naváží se 62,5 g média dehydratovaného trojitého cukru a železného agaru (TSI) a rozpustí se v jednom litru destilované vody.

Zahřívejte, dokud se agar úplně nerozpustí. Vařte minutu a často míchejte. Rozdělte 4 ml média do 13/100 zkumavek s vatovými uzávěry.

Sterilizujte v autoklávu při 121 ° C po dobu 15 minut. Vyjměte z autoklávu a nechte jej v úhlu. Je třeba dbát na to, aby základna i rám byly ve stejné vzdálenosti.

Uchovávejte v chladničce při 2-8 ° C. Před zasetím bakteriálního kmene jej nechte zahřát.

Barva dehydratovaného média je světle béžová a připravené médium je červeno-oranžové.

Konečné pH připraveného média je 7,3 ± 0,2.

Aplikace

Test TSI se široce používá na úrovni mikrobiologické laboratoře. Tento test je nezbytný pro vedení typu testu, který musí být použit k identifikaci rodu a druhu. Jeho dobré provedení a interpretace může ušetřit materiál a práci.

Pokud je výsledkem TSI K / K a test cytochrom oxidázy je pozitivní, je známo, že by se měly použít testy pro identifikaci nefermentujících gramnegativních tyčinek, jako jsou Pseudomonas, Alcaligenes, Achromobacter, Burkholderia, mimo jiné rody. Pokud je oxidáza negativní, je orientována na rod Acinetobacter, Stenotrophomonas atd.

Na druhou stranu, pokud je získána TSI A / A nebo K / A a test cytochrom oxidázy je negativní, čím více dusičnanů se redukuje na dusitany, budeme si jisti, že se jedná o mikroorganismus patřící do rodiny Enterobacteriaceae. V tomto případě se identifikační cesta zaměří na specifické testy pro tuto skupinu bakterií.

Na druhou stranu, pokud je získán obraz K / A nebo A / A a test cytochrom oxidázy je pozitivní, budou další testy, které mají být sestaveny, zaměřeny na identifikaci fermentujících kmenů, které nepatří do čeledi Enterobacteriaceae, jako například: Aeromonas, Plesiomonas, Vibrio a Pasteurella.

Identifikace následujících rodů čeledi Enterobacteriaceae povede TSI se sirovodíkem, oxidázou negativní, Proteus, Citrobacter, Edwardsiella, Leminorella, Pragia, Trabusiella nebo Salmonella.

TSI vztahující se s malým nebo středně sirovodíku v alkalickém zkosení alkalickým pozadí a pozitivní oxidázy, se bude řídit použití testů pro identifikaci nefermentujících Gram negativní tyčky produkující H ₂ S, jako je například Shewanella putrefaciens.

A konečně, TSI lze použít pro výzkum výroby sirovodíku v grampozitivních bacilech, zejména pokud existuje podezření na Erysipelothrix rhusiopathiae.

Zaseté

Prostředek TSI musí být naočkován čistými koloniemi, izolovanými v primárních nebo selektivních kulturách. Pokud je kolonie odebrána ze selektivního média, které bylo naočkováno vzorky smíšené flóry, je třeba dbát na to, aby byla odebrána pouze z povrchu, protože životaschopné kmeny inhibované v tomto médiu mohou existovat ve spodní části kolonie.

Smyčka by proto nikdy neměla být chlazena na selektivním médiu a kolonie je poté odebrána a naočkována médiem TSI.

Výsev se provádí přímou smyčkou nebo jehlou. Provede se propíchnutí, přičemž se postará o to, aby prošel středem, dokud nedosáhne dna, a poté se setí ukončí naočkováním povrchu do tvaru klikatého. Neprovádějte dvě vpichy.

Inkubujte při aerobióze při 37 ° C po dobu 18–24 hodin. Interpretovat v této době, ani předtím, ani po něm.

Omezení

Zkouška TSI by se měla odečíst do 18 až 24 hodin po inkubaci. Odečet před tímto časem může být falešně pozitivní pro fermentaci A / A. Vzhledem k tomu, že odečet po této době může vést k falešně negativnímu obrazu nefermentátoru, kvůli konzumaci peptonů, které alkalizují médium.

Reference

1. Mac Faddin J. (2003). Biochemické testy pro identifikaci bakterií klinického významu. 3. ed. Editorial Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey a Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
3. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
4. "TSI agar." Wikipedia, encyklopedie zdarma. 10. července 2018, 08:09 UTC. 10. února 2019, 03:33 K dispozici na adrese: es.wikipedia.org
5. Britannia Laboratories. TSI agar (trojitý cukrový agar). 2015.K dispozici na: britanialab.com
6. Laboratoře BD. Trojitý agar na bázi cukru a železa (TSI Agar). 2003. K dispozici na adrese: bd.com