CYTOGENETIKA: HISTORIE, CO STUDUJE, TECHNIKY, APLIKACE - BIOLOGIE - 2025

Cytogenetická je studium morfologie, struktury a funkce chromozómů, včetně jejich změn v průběhu somatické buněčné dělení nebo mitóze a během reprodukčního buněčného dělení, nebo meiózy.

Cytologie také studuje faktory, které způsobují chromozomální změny, včetně patologických, které se objevují z jedné generace na druhou, a vývojové, které působí po mnoho generací.

Zdroj: pixabay.com

Dějiny

Nezapomenutelné roky a události v historii cytogenetiky jsou následující:

- V roce 1842 Karl Wilhelm von Nägeli pozoroval „přechodné kmenové buňky“, později nazývané chromozomy.

- V roce 1875 Eduard Strasburger identifikoval chromozomy v rostlinách. V roce 1979 to udělal Walther Flemming u zvířat. Flemming razil pojmy chromatin, profáza, metafáza, anafáza a telopáza.

- V roce 1888 W. Waldeyer razil termín chromozom.

- V roce 1893 vydal Oscar Hertwig první text o cytogenetice.

- V roce 1902 objevili Theodor Boveri a Walter Sutton homologní chromozomy.

- V roce 1905 Nettie Stevens identifikovala chromozom Y.

- V roce 1937 zastavili Albert Blakeslee a AG Avery metafázu s kolchicinem, což výrazně usnadnilo pozorování chromozomů.

- V roce 1968 popsali Torbjörn Caspersson a kol. Pásma Q. V roce 1971 Bernard Dutrillaux a Jerome Lejeune popsali skupiny R.

- V roce 1971 byly skupiny C diskutovány na konferenci o nomenklatuře lidských chromozomů.

- V roce 1975 popsal C. Goodpasture a SE Bloom barvení Ag-NOR.

- V roce 1979 popsal Jorge Yunis metody s vysokým rozlišením pro G pásma.

- V letech 1986–1988 vyvinuli Daniel Pinkel a Joe Gray techniku ​​FISH (fluorescenční in situ hybridizace).

- V roce 1989 mikrodisekované chromozomy Hermann - Josef Lüdecke.

- V roce 1996 popsali Evelyn Schröck a Thomas Ried multichromatické spektrální karyotypické psaní.

Objevy u lidí

V roce 1914 Theodor Boveri navrhl, že rakovina může být způsobena chromozomálními změnami. V roce 1958 Charles E. Ford pozoroval během leukémie chromozomální abnormality.

V roce 1922 publikoval Theophilus Painter, že lidé mají 48 chromozomů. Trvalo až do roku 1956, než Jo Hin Tjio a Albert Levan prokázali, že ve skutečnosti mají 46 chromozomů.

V roce 1932 PJ Waardenburg navrhl, aniž by to dokázal, že Downův syndrom může být výsledkem chromozomální aberace. V roce 1959 prokázal Jerome Lejeune přítomnost extra somatického chromozomu u pacientů s Downovým syndromem.

Také v roce 1959 Charles E. Ford uvedl, že ženy s Turnerovým syndromem postrádají jeden ze dvou chromozomů X, zatímco Patricia Jacobs a John Strong objevily přítomnost chromozomu X navíc u mužů s Klinefelterovým syndromem.

V roce 1960 JA Böök a Berta Santesson popsali triploidii, Klaus Patau popsal trizomii 13 a John Edwards popsal trizomii 18.

V roce 1969 Herbert Lubs poprvé objevil syndrom Fragile X. Ve stejném roce se amniocentéza začala používat pro cytogenetickou diagnostiku.

Obor studia

Cytogenetici studují chromozomální vývoj živých věcí pomocí karyotypů k fylogenetické analýze a řešení taxonomických problémů.

Kromě toho zkoumají epidemiologické aspekty lidských chromozomálních aberací a environmentálních faktorů, které je vytvářejí, diagnostikují a léčí pacienty postižené chromozomálními abnormalitami a vyvíjejí molekulární přístupy k dešifrování struktury, funkce a vývoje chromozomů.

Morfologie chromozomů

Každý chromozom se skládá ze dvou chromatidů, držených pohromadě zúžením zvaným centroméra. Sekce chromozomu, které začínají centromérou, se nazývají zbraně.

Chromozomy se nazývají metacentrické, pokud mají střed ve středu; submetacentrický, pokud jej mají mírně od středu, takže protilehlá ramena nemají stejnou délku; akrocentrický, pokud je centromera blízko jednoho z extrémů; a telocentrické, pokud je centroméra jen na jednom konci chromozomu.

Techniky: zpracování vzorků

Kroky, které je třeba provést ke zpracování vzorků, jsou následující.

Získání vzorku

Pořízení požadované tkáně, její skladování v médiu a ve vhodných lahvičkách.

Kultura

S výjimkou vzorků pro analýzu FISH je před sklizní nutné období kultivace mezi jedním dnem a několika týdny.

Sklizeno

Jedná se o získání buněk v metafáze.

Zastavení mitózy

Standardní cytogenetická analýza vyžaduje zastavení mitózy tak, aby buňky zůstaly v metafázi pomocí kolchicinu nebo Colcemid®.

Hypotonická léčba

Zvyšuje objem buněk, což umožňuje rozšíření chromozomů.

Fixace

Metanol - kyselina octová 3: 1 se používá k odstranění vody z buněk, vytvrzení membrán a chromatinu pro barvení.

Příprava plechů

Fixované buňky se nanesou na mikroskopická sklíčka a poté se vysuší.

Barvení chromozomů

Existuje několik způsobů barvení, které rozpoznávají rozdíly mezi chromozomy. Nejběžnější je G.

Mikroskopická analýza

Umožňuje vybrat vhodné buňky pro pozorování a fotografování chromozomů.

Příprava karyogramů

Na základě fotografií buněk v metafázi jsou pro pozdější studium složeny obrazy sady chromozomů reprezentativní buňky.

Chromozomové pásy

Existují čtyři typy chromozomálních pásů: heterochromatické pásy; euchromatické pásy, oblasti organizující jádro (NOR); kinetochores.

Heterochromatické pásy se objevují jako diskrétní bloky. Odpovídají heterochromatinu, který obsahuje vysoce opakující se sekvence DNA, které představují konvenční geny a nejsou na rozhraní kondenzovány.

Euchromatické pásy se skládají z řady střídajících se segmentů, které jsou nebo nejsou ovlivněny barvením. Tyto pásy se liší velikostí a vytvářejí charakteristické vzory charakteristické pro každou dvojici chromozomů druhu, což je činí velmi užitečnými pro identifikaci chromozomálních translokací a přeskupení.

NOR jsou segmenty chromozomů, které obsahují stovky nebo tisíce ribozomálních RNA genů. Obvykle jsou vizualizovány jako zúžení.

Kinetochores jsou vazebná místa vřetena mikrotubule k chromozomům.

Barvení chromozomálních pásů

Bandování chromozomů spočívá v technikách barvení, které odhalují vzorce podélné diferenciace (světelné a tmavé oblasti), které nebylo jinak vidět. Tyto vzorce umožňují porovnávat různé druhy a studovat vývojové a patologické změny na úrovni chromozomů.

Metody bandování chromozomů jsou rozděleny na ty, které používají absorpční barvení, obvykle pigmenty Giemsa, a ty, které používají fluorescenci. Metody absorpčního barvení vyžadují předběžné fyzikálně-chemické ošetření, jak je popsáno v části „Zpracování vzorků“.

Některé typy pásů umožňují důkaz vzorců omezených oblastí chromozomů souvisejících s funkčními vlastnostmi. Jiné umožňují vizualizaci rozdílů mezi homologními chromozomy, které umožňují identifikovat segmenty.

C kapely

C-pás barví většinu heterochromatických pásů, což z něj činí univerzální techniku, která ukazuje přítomnost heterochromatinu v chromozomech. Jiné metody barví pouze část celkového heterochromatinu, což je činí užitečnějšími než C-pruhování pro rozlišení mezi typy heterochromatinu.

Q pásma

Q-bandážování je nejstarší technikou barvení. Za svůj název vděčí použití chinakrinu. Je účinný bez ohledu na metodu přípravy chromozomů. Je to alternativní metoda k páskování G. Používá se zřídka, ale díky své spolehlivosti je užitečné, když je materiál vzácný nebo obtížně pruhovaný.

G pásma

G-pásmo, založené na použití Giemsy a trypsinu, je dnes nejpoužívanější. Umožňuje detekci translokací, inverzí, delecí a duplikací. Je to nejpoužívanější metoda charakterizace karyotypů u obratlovců, která ukazuje rozdíly mezi chromozomy, které nelze rozlišit pouze na základě jejich morfologie.

R pásma

R bandážování vytváří inverzní zbarvení vzoru G bandování (lehké R pruhy se shodují s tmavými G pruhy a naopak). Pás R je zvláště užitečný pro zvýraznění konců chromozomů, které jsou mírně obarveny, když je použit pás G.

T pásma

T-pásek je varianta R-pásma, ve kterém nedochází k žádnému zbarvení většiny intersticiálních pásů chromozomů, takže terminální oblasti chromozomů jsou intenzivně obarveny.

Skupiny Ag-NOR

Páskování Ag-NOR se používá k nalezení NOR barvením stříbrem. V pásmu Ag-NOR se neaktivní NOR geny nemusí obarvit. Proto se toto páskování používá ke studiu změn v aktivitě ribozomálních genů během gametogeneze a embryonálního vývoje.

Fluorescenční hybridizace in situ (FISH)

FISH banding umožňuje vizualizaci chromozomů pomocí fluorescenčně značených sond. Technologie FISH umožňuje karyotypovou analýzu buněk, které se nerozdělují.

FISH bandování umožňuje detekci specifických sekvencí DNA v chromozomech, buňkách a tkáních. Proto může být použit k detekci chromozomálních abnormalit, které zahrnují malé segmenty DNA.

Bandážování FISH připravilo cestu pro další dvě sofistikovanější související techniky, známé jako spektrální karyotyping (SKY) a vícebarevné FISH (M-FISH).

V SKY a M-FISH se používají fluorescenční barviva, která společně vytvářejí kombinace barev, jednu pro každý chromozom. Tyto techniky byly velmi užitečné při detekci komplexních chromozomálních aberací, jako jsou ty, které byly pozorovány u určitých nádorů a u akutní lymfoblastické leukémie.

Lékařské aplikace

- Cytogenetika rakoviny. V nádorech jsou běžné chromozomální aberace a aneuploidie. Chromozomální translokace mohou mít karcinogenní účinky prostřednictvím produkce fúzních proteinů. Cytogenetika se používá ke sledování průběhu léčby rakoviny.

- Křehká místa a zlomenina chromozomů. Křehká místa chromozomu mohou vést k patologiím, jako je například Fragile X syndrom. Expozice cytotoxickým látkám může způsobit zlomeninu chromozomu. Nosiče určitých autozomálních mutací postrádají schopnost opravit DNA poškozenou během chromozomální fraktury.

- Numerické abnormality chromozomů. Počet chromozomů může diagnostikovat trizomie, jako je ten, který způsobuje Downův, Edwardsův a Patauův syndrom. Umožňuje také diagnostiku Turnerových a Klinefelterových syndromů.

- U chronické myeloidní leukémie mají bílé krvinky chromozom Philadelphia. Tento abnormální chromozom je výsledkem translokace chromozomů 9 a 22.

Reference

1. Abbott, JK, Nordén, AK, Hansson, B. 2017. Vývoj pohlavních chromozomů: historické pohledy a budoucí perspektivy. Sborník Royal Society B, 284, 20162806.
2. Cregan, ERC 2008. Vše o mitóze a meióze. Učitel vytvořil publikování materiálů, Huntington Beach, CA.
3. Gersen, SL, Keagle, MB, eds. 2013. Zásady klinické cytogenetiky. Springer, New York.
4. Gosden, JR, ed. 1994. Methods in molekulární biologie, svazek 29. Protokoly chromozomové analýzy. Humana Press, Totowa, NJ
5. Hughes, JF, Page, DC 2015. Biologie a vývoj chromozomů Y savců. Roční přehled genetiky, 49, 22,1–22,21.
6. Kannan, TP, Alwi, ZB 2009. Cytogenetika: minulost, současnost a budoucnost. Malaysian Journal of Medical Sciences, 16, 4–9.
7. Lawce, HJ, Brown, MG 2017. Cytogenetika: přehled. In: The AGT Cytogenetics Laboratory Manuál, čtvrté vydání. Arsham, MS, Barch, MJ, Lawce, HJ, eds. Wiley, New York.
8. Sacerdot, C., Louis, A., Bon, C., Berthelot, C., Crollius, HR 2018. Vývoj chromozomů na počátku genomu předků obratlovců. Genome Biology, 19, 166.
9. Schubert, I. 2007. Vývoj chromozomů. Aktuální stanovisko v Plant Biology, 10, 109-115.
10. Schulz-Schaeffer, J. 1980. Cytogenetika - rostliny, zvířata, lidé. Springer-Verlag, New York.