CYTOCHEMIE: HISTORIE, PŘEDMĚT STUDIA, UŽITEČNOST A TECHNIKY - BIOLOGIE - 2025

Cytochemie zahrnuje řadu technik, které jsou založeny na identifikaci a odstranění specifických látek uvnitř buňky. To je považováno za větev buněčné biologie, která kombinuje buněčnou morfologii s chemickou strukturou.

Podle Bensleye, zakladatele aplikace moderní cytologie, se uvádí, že účelem cytochemie je objevit chemickou organizaci buněk, aby bylo možné pochopit záhady života. Stejně jako studium dynamických změn, ke kterým dochází během různých funkčních fází.

1: Pagetovo extramamární onemocnění. (Hematoxylin-Eosin) 2: senilní plaky pozorované v mozkové kůře u pacienta s Alzheimerovou chorobou. (Stříbrná impregnace) 3: Králičí jazyk, Kolagenová vlákna (modrá). Svalová vlákna (fialové proužky). (Massonův trichrom). 4: Jaterní tkáň s mastnou degenerací. (Súdán III) 5: Zanícená játra. Nekróza. (Toluidinová modrá) Zdroje: Wikipedia. com / Uživatel: KGH / Public Domain files / Mohit Lalwani

Tímto způsobem je možné určit metabolickou roli těchto látek v buňce.

Cytochemie používá dvě hlavní metody. První je založen na chemických a fyzikálních postupech. Tyto techniky využívají mikroskop jako nezbytný nástroj k vizualizaci chemických reakcí, které se vyskytují na konkrétních látkách v buňce.

Příklad: mimo jiné použití cytochemických barviv, jako je Feulgenova reakce nebo PAS reakce.

Druhá metoda je založena na biochemii a mikrochemii. S touto metodikou je možné kvantitativní stanovení přítomnosti intracelulárních chemikálií.

Mezi látky, které mohou být odhaleny ve tkáňové nebo buněčné struktuře, patří: proteiny, nukleové kyseliny, polysacharidy a lipidy.

Historie cytochemie

Cytochemické techniky od svého vynálezu pomohly pochopit složení buněk a postupem času se objevila řada technik, které používají různé typy barviv s odlišnými afinitami a základními rysy.

Následně cytochemie otevřela nové obzory s použitím určitých substrátů, aby kolorimetricky ukázala přítomnost enzymů nebo jiných molekul v buňce.

Rovněž se objevily další techniky, jako je imunocytochemie, která byla velkou pomocí při diagnostice mnoha chorob. Imunocytochemie je založena na reakcích antigen-protilátka.

Na druhé straně cytochemie také používala fluorescenční látky zvané fluorochromy, které jsou vynikajícími markery pro detekci určitých buněčných struktur. Díky vlastnostem fluorochromu zdůrazňuje struktury, ke kterým je připojen.

Co studuješ?

Různé cytochemické techniky používané na biologickém vzorku mají něco společného: odhalují přítomnost konkrétního typu látky a znají její umístění v hodnocené biologické struktuře, ať už jde o buněčný typ nebo tkáň.

Těmito látkami mohou být enzymy, těžké kovy, lipidy, glykogen a definované chemické skupiny (aldehydy, tyrosin atd.).

Informace poskytované těmito technikami mohou poskytnout vodítko nejen pro identifikaci buněk, ale také pro diagnostiku různých patologií.

Například cytochemické skvrny jsou velmi užitečné při rozlišování mezi různými typy leukémií, protože některé buňky exprimují určité enzymy nebo klíčové látky a jiné ne.

Na druhé straně je třeba poznamenat, že pro použití cytochemie je třeba vzít v úvahu následující skutečnosti:

1) Látka musí být imobilizována na místě, kde je přirozeně nalezena.

2) Látka musí být identifikována pomocí substrátů, které s ní konkrétně reagují, a nikoli s jinými sloučeninami.

Nástroj

Vzorky, které lze studovat pomocí cytochemických technik, jsou:

- Rozšířená periferní krev.

- Rozšířená kostní dřeň.

- Tkáně fixované pro histochemické techniky.

- Buňky fixované cytocentrifugací.

Cytochemické techniky mají velkou podporu v oblasti hematologie, protože se široce používají při diagnostice a diferenciaci určitých typů leukémií.

Například: Esterázové reakce se používají k odlišení myelomonocytární leukémie od akutní monocytární leukémie.

Kostní dřeň a stěry periferní krve od těchto pacientů jsou podobné, protože některé buňky je obtížné morfologicky identifikovat samy. Za tímto účelem se provádí esterázový test.

V první jsou specifické esterázy pozitivní, zatímco ve druhé nespecifické esterázy jsou pozitivní.

Jsou také velmi užitečné v histologii, protože například použitím techniky barvení těžkých kovů (impregnace stříbrem) barví retikulární vlákna intenzivní hnědé barvy v tkáni myokardu.

Techniky v cytochemii

Nejpoužívanější techniky budou vysvětleny níže:

- Použití barviv

Použité skvrny jsou v cytochemických technikách velmi rozdílné a lze je klasifikovat podle několika hledisek:

Podle radikálu, ke kterému mají afinitu

Rozdělují se na: kyselé, bazické nebo neutrální. Jsou nejjednodušší a nejpoužívanější v celé historii, což umožňuje odlišit bazofilní složky od acidofilních. Příklad: barvení hematoxylin-eosinem.

V tomto případě se jádra buněk zbarví modře (berou hematoxylin, což je základní barvení) a cytoplazmy, červená (berou eosin, což je kyselé barvení).

Podle barvy, kterou poskytují

Mohou být ortochromatické nebo metachromatické. Orthochromatické jsou ty, které barví struktury stejnou barvou jako barvivo. Například v případě eosinu, jehož barva je červená a skvrny červené.

Na druhé straně, metachromatické barvení strukturuje jinou barvu než jejich, jako je toluidin, jehož barva je modrá a přesto skvrna fialová.

Vitální nebo supravitální barviva

Jsou to neškodná barviva, to znamená, že vybarvují buňky a zůstávají naživu. Tyto skvrny se nazývají vitální (např. Trypanová modrá pro barvení makrofágů) nebo supravital (např. Janusova zelená pro barvení mitochondrií nebo neutrální červená pro barvení lysozomů).

- Detekce lipidů pomocí tukových barviv

Oxid osmičelý

Barví tuky (nenasycené mastné kyseliny) černé. Tato reakce může být pozorována světelným mikroskopem, ale protože toto barvivo má vysokou hustotu, může být také vizualizováno elektronovým mikroskopem.

Súdán III

Je to jeden z nejpoužívanějších. Toto barvivo difunduje a solubilizuje v tkáních a hromadí se uvnitř lipidových kapiček. Barva je šarlatově červená.

Sudanská černá skvrna B

Vytváří lepší kontrast než předchozí, protože se dokáže rozpustit také ve fosfolipidech a cholesterolu. Je užitečná pro detekci azurofilních a specifických granulí zralých granulocytů a jejich prekurzorů. Proto identifikuje myeloidní leukémie.

- barvení skupiny aldehydů (obarvení periodické kyseliny Schiff)

Barvení pomocí periodické kyseliny Schiff může detekovat tři typy aldehydových skupin. Oni jsou:

- Volné aldehydy, které se přirozeně vyskytují ve tkáních (plazmová reakce).

- Aldehydy produkované selektivní oxidací (reakce PAS).

- Aldehydy generované selektivní hydrolýzou (Feulgenova reakce).

Reakce PAS

Toto barvení je založeno na detekci určitých typů uhlohydrátů, jako je glykogen. Kyselina jodistá Schiff přeruší CC vazby uhlohydrátů v důsledku oxidace glykolových skupin 1 - 2, čímž se uvolní aldehydové skupiny.

Volné aldehydové skupiny reagují se Schiffovým činidlem a tvoří fialově červenou sloučeninu. Vzhled fialově červené barvy vykazuje pozitivní reakci.

Tento test je pozitivní v rostlinných buňkách a detekuje škrob, celulózu, hemicelulózu a peptiny. V živočišných buňkách detekuje muciny, mukoproteiny, kyselinu hyaluronovou a chitin.

Kromě toho je užitečný při diagnostice lymfoblastických leukémií nebo erythroleukémie, mimo jiné patologie myelodysplastického typu.

V případě kyselých uhlohydrátů lze použít alcianské modré skvrny. Zkouška je pozitivní, pokud je pozorována světle modrá / tyrkysová barva.

Plazmová reakce

Plazmatická reakce odhaluje přítomnost určitých alifatických aldehydů s dlouhým řetězcem, jako je dlaň a stearal. Tato technika se používá na zmrazených histologických řezech. Zpracovává se přímo Schiffovým činidlem.

Feulgenova reakce

Tato technika detekuje přítomnost DNA. Tato technika spočívá v tom, že se fixovaná tkáň podrobí slabě kyselé hydrolýze, aby později reagovala se Schiffovým činidlem.

Hydrolýza vystavuje aldehydové skupiny deoxyribózy na vazbě deoxyribóza-purin. Schiffovo činidlo pak reaguje s aldehydovými skupinami, které byly ponechány volné.

Tato reakce je pozitivní v jádrech a negativní v cytoplazmě buněk. Pozitivitu dokazuje přítomnost červené barvy.

Pokud je tato technika kombinována s methyl green-pyroninem, je možné současně detekovat DNA a RNA.

- Cytochemické skvrny pro proteinové struktury

K tomu lze použít Millonovu reakci, která používá jako činidlo dusičnan rtuti. Struktury obsahující aromatické aminokyseliny se zbarví červeně.

- Cytochemické skvrny, které používají substráty k prokázání přítomnosti enzymů

Tyto skvrny jsou založeny na inkubaci biologického vzorku se specifickým substrátem a reakční produkt následně reaguje s diazo solemi za vzniku barevného komplexu.

Esterázy

Tyto enzymy jsou přítomny v lysozomech některých krevních buněk a jsou schopné hydrolyzovat organické estery uvolňující naftol. Ten tvoří nerozpustné azofarbivo, když se váže na diazo sůl, čímž se zafarbí místo, kde dochází k reakci.

Existuje několik substrátů a v závislosti na tom, který je použit, mohou být identifikovány specifické esterázy a nespecifické esterázy. První z nich je přítomen v nezralých buňkách myeloidní řady a druhý v buňkách monocytárního původu.

Substrátem použitým pro stanovení specifických esteráz je: naftol-AS-D chloracetát. Zatímco pro stanovení nespecifických esteráz lze použít několik substrátů, jako je naftol AS-D acetát, alfa naftyl acetát a alfa naftyl butyrát.

V obou případech se buňky zbarví do tmavě červené, když je reakce pozitivní.

Myeloperoxidáza

Tento enzym se nachází v azurofilních granulích granulocytárních buněk a monocytů.

Jeho detekce se používá k odlišení leukémií myeloidního původu od lymfoidních. Buňky obsahující myeloperoxidázy změní barvu na okrově žlutou.

Fosfatázy

Tyto enzymy uvolňují kyseliny fosforečné z různých substrátů. Liší se od sebe podle specifičnosti substrátu, pH a působení inhibitorů a inaktivátorů.

Mezi nejznámější patří fosfomonoesterázy, které hydrolyzují jednoduché estery (PO). Příklad: alkalická fosfatáza a kyselá fosfatáza, jakož i fosfamidázy, které hydrolyzují vazby (PN). Používají se k diferenciaci lymfoproliferačních syndromů ak diagnostice leukémie vlasatých buněk.

- Trichromická zbarvení

Mallary-azanský trichrom

Jsou užitečné pro odlišení cytoplazmy buněk od vláken pojivové tkáně. Buňky barví červenou a kolagenová vlákna modrá.

Massonův trichrom

To má stejnou užitečnost jako předchozí, ale v tomto případě buňky zbarví červeně a kolagenová vlákna zelená.

- Barviva, která barví specifické organely

Janus Green

Selektivně barví mitochondrie.

Stříbrné soli a kyselina osmová

Barví Golgiho aparát.

Toluidinová modrá

Skvrny Nissiho těla

Stříbrné soli a PAS

Zašpiní retikulární vlákna a bazální laminu.

Resorcin orceinu a fuchsinu

Barví elastická vlákna. První jsou obarveny hnědé a druhé tmavě modré nebo fialové.

- Další techniky používané v cytochemii

Použití fluorescenčních látek nebo fluorochromů

Existují techniky, které používají fluorescenční látky ke studiu umístění struktury v buňce. Tyto reakce jsou vizualizovány speciálním mikroskopem zvaným fluorescence. Příklad: IFI technika (nepřímá imunofluorescence).

Detekce buněčných složek imunocytochemií

Tyto techniky jsou velmi užitečné v medicíně, protože pomáhají detekovat určitou buněčnou strukturu a také ji kvantifikovat. Tato reakce je založena na reakci antigen-protilátka. Například: techniky ELISA (Enzyme Immuno Assay).

doporučení

- Pro vyhodnocení dobrého výkonu barviv je nutné použít kontrolní nátěry.

- Pro cytochemické barvení by měly být použity čerstvé nátěry. Pokud to není možné, měly by být chráněny před světlem a skladovány při 4 ° C.

- Je třeba dbát na to, aby použitý fixační prostředek nepříznivě neovlivnil zkoušenou látku. Jinými slovy, musí být zabráněno tomu, aby jej bylo možné extrahovat nebo inhibovat.

- Musí se dodržovat doba použití fixačních prostředků, protože obecně by měla trvat pouze sekundy, protože vystavení nátěru delší dobu fixačnímu prostředku může poškodit některé enzymy.

Reference

1. "Cytochemie." Wikipedia, encyklopedie zdarma. 30. června 2018, 17:34 UTC. 9. července 2019, 02:53 K dispozici v: wikipedia.org
2. Villarroel P, de Suárez C. Metody kovové impregnace pro studium myokardiálních vláknitých vláken: srovnávací studie. RFM 2002; 25 (2): 224-230. K dispozici na adrese: scielo.org
3. Santana A, Lemes A, Bolaños B, Parra A, Martín M, Molero T. Cytochemie kyselé fosfatázy: metodologické úvahy. Rev Diagn Biol. 200; 50 (2): 89-92. K dispozici na adrese: scielo.org
4. De Robertis E, De Robertis M. (1986). Buněčná a molekulární biologie. 11. vydání. Redakční Ateneo. Buenos Aires, Argentina.
5. Klasické nástroje pro studium buněčné biologie. TP 1 (doplňkový materiál) - buněčná biologie. K dispozici na adrese: dbbe.fcen.uba.ar