DAPI (4 ', 6-DIAMIDINO-2-FENYLINDOL): CHARAKTERISTIKA, ODŮVODNĚNÍ, POUŽITÍ - CHEMIE - 2025

DAPI (4‘, 6-diamino-2-fenylindolu) je barvivo fluorescenční vlastnost slouží jako je marker, široce používané ve stavu techniky z fluorescenční mikroskopie nebo průtoková cytometrie, mimo jiné. Fluorescence, kterou vyzařuje, je jasně modrá, k její excitaci dochází mezi 455-461 nm (UV světlo).

DAPI barvivo může velmi snadno procházet buněčnou membránou mrtvých buněk. Může také barvit jádra živých buněk, ale v tomto případě musí být koncentrace těchto buněk vyšší.

Chemická struktura fluorescenčního barviva DAPI. Zdroj: Obrázek: Soubor: DAPI.svg je vektorová verze tohoto souboru. Měl by být použit místo tohoto rastrového obrázku, pokud není nižší / Richard Wheeler (Zephyris) Upravený obrázek

Barvivo je schopné přistupovat k buněčné DNA, pro kterou má zvláštní afinitu a váže se s velkou aviditou na dusíkaté báze adenin a thymin. Z tohoto důvodu je velmi užitečný v některých technikách molekulární biologie.

Tato sloučenina patří do skupiny indolových barviv a ukázalo se, že má větší citlivost na DNA než ethidiumbromid a propidiumjodid, zejména na agarózových gelech.

Použití tohoto fluorescenčního barviva je velmi široké, protože je užitečné pro: studium změn DNA v apoptotických procesech (buněčná smrt), a proto detekování buněk v tomto procesu; pro DNA footprinting photo (DNA photo printing); studovat bakteriální kontaminaci; nebo vizualizovat jadernou segmentaci.

Používá se také při studiu chromozomálních pásů, při detekci Mycoplasmas sp DNA, při interakci DNA-protein, při barvení a počítání buněk imunofluorescencí a dokonce i při barvení zralých pylových zrn.

vlastnosti

DAPI je zkratka jeho chemického názvu (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol). Jeho molekulární vzorec je C ₁₆ H ₁₅ N ₅ má molekulovou hmotnost 350,3. V blízkosti UV světla (345 až 358 nm) dochází k maximální excitaci komplexu DAPI-DNA, zatímco maximální emise fluorescence se vyskytuje mezi 455-461 nm.

Toto barvivo je charakterizováno jako žlutý prášek, ale struktury označené tímto fluoroforem emitují brilantní modré světlo.

Je to sloučenina rozpustná ve vodě, ale pro urychlení jejího rozpuštění může být aplikováno určité teplo. Může být naředěn PBS, ale v něm není přímo rozpuštěn.

Jakmile je barvivo připraveno, musí být skladováno ve tmě, tj. Chráněno před světlem, při teplotě 2 až 8 ° C (lednička). Za těchto podmínek je barvivo stabilní déle než 3 týdny nebo měsíce.

Je-li chráněno před světlem, ale ponecháno při pokojové teplotě, jeho stabilita klesne na 2 nebo 3 týdny, ale při vystavení přímému světlu je zhoršení velmi rychlé. Pokud chcete skladovat mnohem déle, lze jej chlazit při -20 ° C a distribuovat v alikvotech.

Základ

Toto barvení je založeno na generování jaderné kontrastní barvy v hlavních technikách molekulární biologie, jako jsou: průtoková cytometrie, fluorescenční mikroskopie a barvení chromozomů metafáz nebo jader fází interfází.

Tato technika je založena na velké afinitě, kterou má barvivo pro dusíkaté báze (adenin a thymin) obsažené v genetickém materiálu (DNA) v malé drážce. Zatímco na cytoplazmatické úrovni, zanechává velmi málo pozadí.

Když se fluorescenční barvivo váže na adeninové a thyminové oblasti DNA, fluorescence se výrazně zvyšuje (20krát více). Barva, kterou vydává, je jasně modrá. Zejména neexistuje žádná emise fluorescence při vazbě na páry bází GC (guanin-cytosin).

Je důležité si uvědomit, že ačkoli má také afinitu k RNA, nezpůsobuje to problém, protože k nejvyššímu stupni energetické emise z této molekuly dochází na jiné vlnové délce (500 nm), na rozdíl od DNA, která tak činí při 460 nm. Kromě toho je nárůst fluorescence po navázání na RNA pouze 20%.

DAPI se používá více k barvení mrtvých (fixovaných) buněk než živých buněk, protože k jejich barvení je zapotřebí mnohem vyšší koncentrace barviva, protože buněčná membrána je mnohem méně propustná pro DAPI, když je naživu.

DAPI barvivo lze použít v kombinaci s červenými a zelenými fluorofory pro vícebarevný zážitek.

Použití

DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) je vynikající fluorofor, a proto se široce používá v různých technikách a pro různé účely. Následující text vysvětluje použití DAPI v hlavních technikách.

Průtoková cytometrie

Vědci Gohde, Schumann a Zante v roce 1978 jako první použili a navrhli DAPI jako fluorofor v technice průtokové cytometrie, která měla velký úspěch díky vysoké citlivosti na DNA a vysoké intenzitě fluorescenční emise.

Použití DAPI v této technice umožňuje studium buněčného cyklu, kvantifikaci buněk a barvení živých a mrtvých buněk.

Ačkoli existují i ​​jiná barviva, jako je ethidiumbromid, Hoechstův oxid, akridinová oranžová a propidiumjodid, DAPI je jedním z nejrozšířenějších, protože je více fotostabilní než dříve uvedená.

Pro tuto techniku ​​je nutné buňky fixovat, pro tento absolutní ethanol nebo 4% paraformaldehyd lze použít. Vzorek se odstředí a supernatant se odstraní, následně se buňky hydratují přidáním 5 ml PBS pufru po dobu 15 minut.

Po uplynutí času připravte barvení DAPI barvicím pufrem (FOXP3 od BioLegend) v koncentraci 3 uM.

Vzorek se odstředí, supernatant se odstraní a poté se přikape 1 ml roztoku DAPI po dobu 15 minut při pokojové teplotě.

Odebrat vzorek do průtokového cytometru pomocí vhodného laseru.

Průtoková mikrofluorometrie

Další technikou, ve které se používá DAPI, je průtoková mikrofluorometrie spolu s dalším fluoroforem zvaným mithramycin. Oba jsou užitečné pro individuální kvantifikaci chloroplastové DNA, ale DAPI je nejvhodnější pro měření částic bakteriofága T4.

Hybridizace

Tato technika v zásadě používá DNA sondy značené fluorescenčním barvivem, kterým může být DAPI.

Vzorek vyžaduje tepelné ošetření, aby denaturoval dvouvláknovou DNA a převedl ji na dva jednovláknové řetězce. Následně se hybridizuje s denaturovanou sondou DNA značenou DAPI, která má sled sledu.

Později se promývá, aby se vyloučilo to, co nebylo hybridizováno, pro vizualizaci DNA se použije kontrast. Fluorescenční mikroskop umožňuje pozorování hybridizované sondy.

Účelem této techniky je detekovat specifické sekvence v chromozomální DNA a umožnit diagnostiku určitých chorob.

Tyto cyto-molekulární techniky byly velkou pomocí při určování podrobností ve studiu karyotypů. Například ukázal oblasti bohaté na páru bází adenosinu a thyinu nazývané heterochromatické oblasti nebo DAPI pásy.

Tato technika je široce používána pro studium chromozomů a chromatinu u rostlin a zvířat, jakož i pro diagnostiku prenatálních a hematologických patologií u lidí.

V této technice je doporučená koncentrace DAPI 150 ng / ml po dobu 15 minut.

Sestavená sklíčka by měla být skladována chráněna před světlem při 2-8 ° C.

Imunofluorescenční barvení

Buňky jsou fixovány 4% paraformaldehydem. Pokud se mají použít další skvrny, DAPI se ponechá na konci jako kontrastní barvivo a buňky se pokryjí roztokem PBS po dobu 15 minut. Po uplynutí času připravte roztok DAPI zředěním PBS tak, aby konečná koncentrace byla 300 uM.

Pak se přebytek PBS odstraní a přikryje se DAPI po dobu 5 minut. Praní několikrát. Sklíčko je pozorováno pod fluorescenčním mikroskopem pod příslušným filtrem.

Bezpečnostní list

S touto sloučeninou je třeba zacházet opatrně, protože se jedná o sloučeninu, která má mutagenní vlastnosti. Aktivní uhlí se používá k odstranění této sloučeniny z vodných roztoků, které mají být odstraněny.

Aby se předešlo nehodám s tímto činidlem, musí být použity rukavice, šaty a ochranné brýle. Pokud dojde ke kontaktu s kůží nebo sliznicí, je třeba oblast umýt dostatečným množstvím vody.

Nikdy byste neměli pipetovat toto činidlo ústy, použijte pipety.

Nekontaminujte činidlo mikrobiálními látkami, protože to povede k chybným výsledkům.

Neřeďte DAPI skvrnu více, než je doporučeno, protože to výrazně sníží kvalitu skvrny.

Nevystavujte činidlo přímému světlu, ani jej neuchovávejte, protože to snižuje fluorescenci.

Reference

1. Brammer S, Toniazzo C a Poersch L. Corantes se běžně podílejí na cytogenetice rostlin. Arq. Inst. Biol. 2015, 82. K dispozici od: scielo.
2. Impath Laboratories. DAPI. K dispozici na adrese: menarinidiagnostics.com/
3. Cytocell Laboratories. 2019. Návod k použití DAPI. k dispozici na cytocell.com
4. Elosegi A, Sabater S. Koncepce a techniky v říční ekologii. (2009). Editorial Rubes, Španělsko. K dispozici na adrese: books.google.co.ve/
5. Novaes R, Penitente A, Talvani A, Natali A, Neves C, Maldonado I. Použití fluorescence v modifikované disektorové metodě k odhadu počtu myocytů v srdeční tkáni. Arch. Bras. Cardiol. 2012; 98 (3): 252-258. K dispozici od: scielo.
6. Rojas-Martínez R, Zavaleta-Mejía E, Rivas-Valencia P. Přítomnost fytoplasmů v papáji (Carica papaya) v Mexiku. Chapingo Magazine. Zahradnická řada, 2011; 17 (1), 47-50. K dispozici na adrese: scielo.org.