BAKTERIÁLNÍ NÁTĚR: VLASTNOSTI A PŘÍPRAVA - BIOLOGIE - 2025

Bakteriální skvrna je tenký film skvrna suspenze bakteriálních mikroorganismů, které je vyrobeno z průhledné skleněné desky nebo sklíčko, na pozorování pod světelným mikroskopem.

Prodloužení ve formě filmu se provádí za účelem co největšího oddělení mikroorganismů, protože pokud jsou seskupeny, není pozorování jasné.

Obrázek 1. Bakteriální nátěr viděný pod skenovacím elektronovým mikroskopem. Zdroj: pixbay.com

Při studiu bakteriálních kultur se pro jejich lepší analýzu používají techniky přípravy stěr, fixace a barvení. Vzhledem k malé velikosti mikroorganismů je pro jejich pozorování nezbytně nutné použití optického mikroskopu.

Optické mikroskopy jsou nezbytnými nástroji pro pozorování nátěrů. Používají optické čočky a světlo umožňující prohlížení vzorků s velkým zvětšením.

Obecně živé buňky nemají většinou barevné struktury, viděné světelným mikroskopem, jsou to bezbarvé, průhledné vzorky a vykazují velmi malý vnitřní kontrast a své okolí.

Pozorování pomocí jednoduchého světelného mikroskopu světelného pole, bez použití pomocných technik barvení, je velmi omezené a používá se pouze v některých případech, například při pozorování pohybu mikroorganismů.

Pro optimální pozorování mikroorganismů je třeba dosáhnout rovnováhy mezi kontrastem a rozlišením. Detaily buněk nelze pod mikroskopem vidět, a to ani s vysokým rozlišením; Použití barviv je vyžadováno barvicími technikami, které poskytují kontrast pro pozorování.

Charakteristiky kvalitního bakteriálního nátěru

Vynikající kontrast

Pro dosažení vynikajícího kontrastu existují sofistikované mikroskopy nazývané mikroskopy s fázovým kontrastem, mikroskopy s diferenční interferencí a mikroskopy s tmavým polem. Tento typ mikroskopu se mimo jiné používá k pozorování bakteriálních struktur, jako jsou pláště a vlákna.

Barvení je jednoduchá technika zvyšování kontrastu, která je dosahována mikroskopem s jasným polem. V této technice mohou být použity různé skvrny, které výrazně zlepšují mikroskopické pozorování.

Skvrny se provádějí přímo na nátěrech nebo prodloužení suspenzí mikroorganismů na podložních sklíčkach, předem se vysuší a fixují.

Dobrá oprava

Fixace je technika používaná k zachování buněčných struktur; způsobuje inaktivaci mikroorganismů a přilnutí ke sklu sklíčka. Existují různé způsoby fixace: tepelná fixace a chemická fixace.

Tepelná fixace

Toto je nejpoužívanější metoda pro pozorování bakteriálních nátěrů. Tato technika spočívá v průchodu bakteriální suspenze nátěru plamenem zapalovače. Tato technika je schopna zachovat vnější morfologii bakterií, ale ničí jejich vnitřní struktury.

Chemická fixace

Chemická fixace používá mimo jiné konzervační chemikálie, jako je formaldehyd nebo formalin, ethanol a kyselina octová. Výhodou použití chemických fixačních činidel je, že je dosaženo ochrany vnitřních buněčných struktur mikroorganismů.

Obrázek 2. Krevní nátěr. Zdroj: Bobjgalindo, z Wikimedia Commons

Dobré zbarvení

Nejběžnější postupy pro barvení dříve vysušeného a fixovaného nátěru jsou pozitivní nebo jednoduché barvení, diferenciální barvení a negativní barvení. Existují také speciální techniky pro barvení konkrétních buněčných struktur (kapsle, spor, bičíky).

Pozitivní barvení nebo jednoduché barvení

Pozitivní nebo jednoduché barvení je nejčastěji používanou technikou barvení stěrem. Používá barviva, která mají schopnost vázat se na určité mikrobiální struktury, což umožňuje jejich pozorování pod mikroskopem.

Tato barviva mají ve své chemické struktuře chromoforové skupiny (barevná část) se střídavými dvojnými vazbami a jednoduchými vazbami (konjugace). Tyto vazby mohou zase vytvořit iontové nebo kovalentní vazby s některými buněčnými strukturami.

Barviva použitá při pozitivním nebo jednoduchém barvení jsou většinou chemické deriváty anilinu (barevné organické soli).

Na druhé straně mezi barvivy najdeme některá s bazickým pH a jiná s kyselým pH.

Základní barviva

V základních barvivech má chromoforová skupina kladný elektrický náboj. Převážná většina prokaryotických mikroorganismů má neutrální vnitřní pH a jejich buněčný povrch je negativně nabitý. Díky této elektrostatické interakci se chromofor váže na buňku a obarví ji.

Příklady základních barviv jsou mimo jiné methylenová modrá, křišťálová fialová, malachitová zelená, základní fuscin, safranin.

Kyselinová barviva

V kyselých barvivech má skupina chromoforů záporný elektrický náboj. Používají se k barvení proteinů pozitivně nabitými aminoskupinami. Příklady kyselých barviv jsou kyselý fuscin, růže Bengálsko, Kongo červená a eosin.

Diferenciální barvení

Technika diferenciálního barvení spočívá v aplikaci dvou barviv různé barvy nebo intenzity k rozlišení různých mikroorganismů pod mikroskopem. Gramovo barvení a barvení odolné vůči kyselinám a alkoholu jsou nejčastěji používanými diferenciálními barvivy v bakteriologii.

Gramovo barvení se používá jako předběžný test k poznání tvaru, velikosti, buněčného seskupení a typu buněčné stěny. Pomocí testu barvení podle Grama jsou bakterie buněčné stěny klasifikovány na grampozitivní bakterie a grampozitivní bakterie.

Negativní barvení

V této technice se používají chemická barviva, která nepronikají dovnitř buňky, ale vytvářejí médium, ve kterém se mikroorganismy objevují jako černé pozadí.

Při technice negativního barvení je stěr vyroben kapkou indického inkoustu nebo suspenze nigrosinu, která po umožnění sušení při teplotě místnosti vytvoří neprůhledný film procházející světlem. Tímto způsobem se mikroorganismy objevují jako světlé tvary na tmavém pozadí.

Příprava

A. Rozmazat

1.- Vyjměte sklíčka velmi dobře, osušte savým papírem a označte je. Na etiketě musí být uveden obsah přípravku, datum a jméno osoby, která přípravek zpracovala.

2.- Zapálte zapalovač a sterilizujte očkovací smyčku v plameni, dokud nebude jasně červená.

3.- Nechte rukojeť vychladnout.

4.- Vezměte zkumavku s bakteriální kulturou, sejměte víčko a rychle protáhněte ústa zkumavky v blízkosti plamene hořáku (plamen).

5. Vložte inokulační smyčku do zkumavky obsahující bakteriální kulturu a odeberte vzorek.

6. - Pokud je kultura v tekutém médiu, umístěte vzorek odebraný s držadlem do středu sklíčka a opatrně jej rozprostřete do kruhu o průměru přibližně 2 cm.

7.- Znovu sterilizujte očkovací smyčku.

8.- Nechte nátěr zaschnout na vzduchu.

9.- Opakujte kroky 3 až 8 třikrát.

10.- Pokud je kultura v pevném médiu, musí být na sklíčko předem umístěna kapka destilované vody. To se provádí pro smíchání malého vzorku kultury odebrané s očkovací smyčkou, jak je uvedeno v krocích 2 až 5 (aseptické podmínky).

11.- Nařeďte zředěný vzorek kapkou vody na sklíčko a opakujte třikrát.

B. Fixace

1.- Do suchých nátěrů - z kultur v kapalném médiu - přidejte dvě kapky methanolu nebo absolutního ethanolu.

2.- Nechte uschnout vzduch ze zapalovače.

3.- Pokud nátěr pochází z kultury v pevném médiu, suchý nátěr se fixuje teplem a 2 až 3krát rychle prochází nejteplejší částí lehčího plamene.

4.- Dotkněte se spodní části nátěru hřbetní částí levé ruky (pro praváky, jinak použijte pravou ruku) a ověřte, že je studená.

C. Jednoduché barvení

1.- Přidejte do nátěru 2 kapky vybrané skvrny a nechte ji působit po dobu potřebnou ve specifických protokolech pro každou skvrnu (obvykle mezi 1 a 5 minutami).

2.- Některé skvrny vyžadují pro jejich aktivaci použití tepla, v takovém případě je třeba při zahřívání sklíčka v zapalovači plamen velmi opatrně (manipulovat s pinzetou a zabránit varu). Přehřátí nátěru může zničit pozorované buňky.

3.- Přebytečné barvivo odstraňte promytím destilovanou vodou z pikniku. Odstraňte mycí vodu jemným poklepáním na její okraj, nakloněný na pracovním stole.

4.- Nechte uschnout na vzduchu.

5.- V závislosti na typu pozorování se v této fázi používá nebo ne. Krycí sklíčko chrání a zachovává nátěr. Pokud se v této fázi provede pozorování olejové imerze, nepoužívají se žádné krycí sklíčka, ale nátěr nelze zachovat.

D. Definitivní zachování nátěru

1.- Nátěr postupně ponořte do každého z níže uvedených řešení po dobu minimálně 5 minut. Účelem těchto "koupelí" je úplné dehydratování nátěru. Každé činidlo by mělo být před zavedením nátěru do další lázně důkladně vypuštěno.

Pořadí dehydratačních lázní je následující:

1. Ethanol 70%
2. Ethanol 95%
3. Čistý aceton
4. Směs aceton -xylol 1: 1
5. Xylol

Poté nechte uschnout na vzduchu.

2. - Krycí sklíčko, nejlépe 22 × 22 mm, namontujte pomocí balzamu Kanady nebo jiného montážního média.

Reference

1. Briggs, G. (1965). Příčinné faktory při mikrobiologických laboratorních nehodách a infekcích. US Army Biological Laboratories. Fort Detrick.
2. Cappucino, JG a Welch, CT (2017). Mikrobiologie: laboratorní příručka. Pearson.
3. Holt, editor JG. (1977). Kratší Bergeyův manuál determinativní bakteriologie. 8 ^th Baltimore: Williams a Wilkins Co.
4. Johnson, TR a Case; CL (2018). Laboratorní experimenty v mikrobiologii. Pearson.
5. Tille, P. (2017). Diagnostická mikrobiologie. 14 ^th St. Louis, USA: Elsiever, Inc.