SEKVENOVÁNÍ DNA: MAXAM-GILBERT, METODA A PŘÍKLADY - BIOLOGIE - 2025

Sekvenování DNA (deoxyribonukleová kyselina), je postup, v laboratořích, molekulární biologie, který umožňuje, aby znát pořadí nukleotidů v genetickém materiálu je předmětem zájmu. Dále může být také popsáno sekvenování RNA (ribonukleová kyselina).

Tato technika byla nezbytná pro rozvoj biologických věd. Platí také pro další oblasti znalostí - například pro lékařské diagnózy a forenzní vyšetřování.

Zdroj: pixabay.com

Dříve bylo sekvenování řetězce DNA považováno za pomalou a nákladnou aktivitu, která umožnila identifikaci pouze několika párů bází v oligonukleotidech.

Dnes, se všemi vědeckými pokroky, je sekvenování DNA rutinní operací v mnoha laboratořích po celém světě díky příspěvku téměř 50 let výzkumu v této oblasti. Pokud jde o délku řetězce, lze ve velmi krátké době sekvenovat až miliony párů bází.

Za tímto účelem existují desítky vyvinutých technik, které se liší cenou a přesností. V tomto článku popíšeme klasické i moderní techniky, z nichž každá má své výhody a nevýhody.

Doposud umožňují sekvenční techniky získání sekvence úplných genomů, od malých prokaryot a kvasinek po lidský genom.

Struktura DNA

Abychom porozuměli metodám a technikám používaným pro sekvenování DNA, je nutné znát některé klíčové aspekty struktury a složení molekuly.

DNA je biomolekula nalezená ve všech živých věcech, od bakterií po velká vodní zvířata. Organely - jako mitochondrie a chloroplasty - mají v sobě kruhovou molekulu DNA. I u některých virů je genetickým materiálem DNA.

Strukturálně je DNA soubor nukleotidů. Každý z nich je tvořen uhlohydrátem, dusíkatou bází (A, T, C nebo G) a fosfátovou skupinou. Cílem sekvenování DNA je odhalit pořadí, ve kterém jsou v sekvenci nalezeny čtyři dusíkaté báze.

Dějiny

V polovině 50. let vědci Watson a Crick popsali strukturu DNA pomocí christolografických technik. Žádný z těchto vědců však nebyl schopen najít způsob, jak posloupnost odhalit.

Ačkoli existovali určití předchůdci, nejdůležitější událostí bylo vytvoření Sangerovy metody v roce 1977. Otec této metody Frederick Sanger byl britským biochemikem, držitelem dvou Nobelových cen za jeho obrovský přínos pro biologické vědy.

Tato technika je v literatuře známa také jako „ukončení řetězce“ nebo dideoxynukleotidy. Principy této techniky a ty, které byly vyvinuty na základě jejího zlepšení a inovací, budou popsány níže.

Sangerova metoda

Vývoj Sangerovy metody představoval klíčovou událost v molekulární biologii. Zahrnuje základní složky procesu replikace DNA, které se běžně vyskytují v buňce, ale přidává zvláštní složku: dideoxynukleotidy.

Hlavní složky reakce

- DNA polymeráza: enzym DNA polymerázy je klíčovým prvkem procesu. Tato molekula se účastní replikace řetězce DNA a jeho úlohou je syntéza nového řetězce, spárování trifosfát deoxyribonukleotidů s komplementárními.

Připomeňme, že v DNA se tyminy (T) spárují s adeniny (A) prostřednictvím dvou vodíkových vazeb, zatímco cytosin (C) to dělá s guaninem (G) prostřednictvím tří vazeb.

- Nukleotidy: Sangerovo sekvenování zahrnuje dva typy nukleotidů, čtyři 2'-deoxynukleotidy (ve zkratce dATP, dGTP, dCTP a dTTP) a čtyři dideoxynukleotidy (ddATP, ddGTP, ddCTP a ddTTP).

Ačkoli jsou dideoxynukleotidy podobné monomerům, které jsou normálně zabudovány do DNA, postrádají ve své struktuře skupinu -OH. To znemožňuje přidání nového nukleotidu do řetězce.

Proto, když je speciální řetězec - zcela náhodným způsobem - přidán do řetězce při tvorbě, syntéza je paralyzována. Na konci reakce tedy existují řetězce různých velikostí, z nichž každý byl zastaven v jiném bodě.

Experimentálně se připravují čtyři testy. Každá obsahuje DNA extrahovanou z biologického vzorku, který je předmětem zájmu, normální nukleotidy a jeden ze čtyř speciálních typů nukleotidů. Buď jsou speciální nukleotidy označeny nějakým typem fluorescenčního markeru (viz automatické sekvenování níže).

Čtení výsledků

Prvním krokem je oddělení každého ze syntetizovaných řetězců podle jejich velikosti. Některé budou delší než jiné, v závislosti na tom, kde byly začleněny speciální základny.

Existují různé biochemické techniky, které umožňují separaci složek směsi pomocí velikosti jako diskriminační vlastnosti. V Sangerově metodě jsou jednotlivé řetězce separovány elektroforézou. V sofistikovanějších variantách techniky se používá kapilární elektroforéza.

Delší prameny tedy cestují méně než kratší varianty. Tento systém pak prochází čtečkou, která rozpoznává marker obsažený v každém dideoxynukleotidu. Tímto způsobem může být známo pořadí sekvence.

Tato technika „první generace“ je schopna číst fragmenty DNA ne větší než 1 kilobáza. V současnosti se metoda Sanger používá v různých laboratořích, obecně v moderních variantách. Kromě toho se používá k potvrzení výsledků získaných pomocí nejsložitějších technik - ale méně přesných.

Automatické řazení

Pokud je vyžadováno sekvenování ve velkém měřítku, je proces automatizací urychlen. Jedná se o variantu metody zakončení řetězce Sanger, kde jsou primery značeny fluorescenčními produkty, aby byly rozlišeny.

Následně se reakční produkt zpracovává elektroforézou - vše v jednom pruhu. Jak každý fragment opouští finální část gelu, je rychle identifikován pomocí fluorescenčního značení, s chybou obklopující 1%.

Nejmodernější systémy mají systém až 96 kapilárních trubic spravovaných počítačem spojeným s robotem. To znamená, že 96 vzorků DNA lze testovat současně. Proces zahrnující elektroforézu a analýzu výsledků je tedy plně automatizovaný.

Za jeden den mohou tyto systémy posloupnost až 550 000 bází. Během procesu je lidská práce zbytečná, spuštění metody trvá přibližně 15 minut.

Maxam-Gilbertovo sekvenování

Ve stejné době, kdy Sanger publikoval svou práci, se dvěma vědcům jménem Allan Maxan a Walter Gilbert podařilo vyvinout další metodu k získání sekvence DNA. Metoda získala popularitu v té době, ale byl později přemístěn zlepšením Sangerovy metody.

Na rozdíl od Sangerovy metody nezahrnují Maxan a Gilbertové sekvenování (nebo chemické sekvenování, jak je také známo) hybridizační reakce. Metodika spočívá v označování reaktivními činidly na jednom konci a následném procesu čištění.

Jeden z negativních aspektů této techniky spočívá v její obrovské složitosti a v používání chemikálií, které jsou pro uživatele nebezpečné. Chemické zlomy jsou vyvolány aplikací DMS, kyseliny mravenčí, hydrazinu a hydrazinu se solemi.

Proces

Protokol začíná značením na 5 'konci řetězce fosforovým markerem 32, potom nastane chemická modifikace dusíkové báze a je oddělena. Nakonec dochází ke štěpení abasické oblasti.

Nejprve zkrátíte řetězec, který chcete sekvenovat, do menších segmentů. Tento krok se provádí restrikčními enzymy, jejichž výsledkem jsou vyčnívající konce.

Dále se reakce provádí s alkalickou fosfatázou, jejímž účelem je eliminace fosfátové skupiny. Polynukleotid kináza tedy může být použita k provedení značení.

Řetěz je denaturován (oba prameny jsou otevřené). Poté se aplikují chemikálie. Tyto štěpné reakce se provádějí kontrolovaným způsobem a je známo, jaké typy vazeb se každá aplikovaná chemická látka rozbije.

Čtení výsledků

Stejně jako v Sangerově metodě zahrnuje čtení výsledků separaci podle velikosti řetězců získaných v elektroforézním systému. Systémy složené z polyakrylamidu umožňují získat velmi vhodné rozlišení pro čtení gelu.

Hromadné sekvenování

Masivní sekvenování zahrnuje řadu nových metod, zkrácených jako NGS, z anglického „Next Generation Sequencing“.

Metody klasifikované jako NGS vyžadují předchozí krok amplifikace DNA (nepracují s jedinou molekulou). Používané platformy se navíc velmi liší. Principy nejpopulárnějších metod budou popsány níže:

Pyrosekvenování

Zahrnuje monitorování uvolňování pyrofosfátu, ke kterému dochází při každém přidání nového nukleotidu do řetězce DNA. Systém enzymů je spojen, takže k emisi světla (které je detekovatelné kamerou) dochází vždy, když je začleněn nový nukleotid.

Proces začíná samostatnou inkubací každé dusíkaté báze, aby se ověřilo, zda existuje nebo není vydána světla. Pyrosekvenování umí číst dlouhé řetězce, ale zjištěná míra chyb je vysoká.

Syntetické sekvenování

To zahrnuje inkorporaci značených nukleotidů. Tyto fluorescenční složky se přidají, promyjí a zaznamená se zabudovaný nukleotid. Potom je nukleotidová značka odstraněna a syntéza vlákna může pokračovat. V dalším kroku bude také začleněn značený nukleotid a výše uvedené kroky budou opakovány.

Nevýhodou této techniky je, když fluorescenční markery nejsou úplně odstraněny. Tyto emise vytvářejí chyby na pozadí, což má za následek významné chyby.

Ligační sekvenování

Tato technika se liší od ostatních, protože nepoužívá DNA polymerázu. Místo toho je klíčovým enzymem pro tuto metodiku ligáza. Zde se používají fluorescenčně značené fragmenty DNA, jsou spojeny enzymem a jsou detekovány.

Největším problémem této techniky je krátká délka fragmentu, kterou dokáže zpracovat.

Ion Torrent Sequencing

Tato technika je založena na měření H ⁺ iontu, který je uvolňován pokaždé, když je začleněn nový nukleotid. Princip je docela podobný pyroekvenaci, ale mnohem levnější.

Příklady

Sekvenování lidského genomu

Sekvenování lidského genomu bylo jednou z nejslibnějších výzev v biologii a také jedním z nejuznávanějších soupeření v historii vědy. Ve skutečnosti pro vědce zapojené do projektu se sekvencování genomu stalo konkurencí.

V roce 1990 zahájil tzv. „Projekt lidského genomu“ pod vedením slavného vědce, nositele Nobelovy ceny, Jamese Watsona. Po roce, v roce 1991, Venter přijme výzvu „porazit“ Watsona a sekvencovat genom před sebou. V roce 1992 však Watson odešel do důchodu a příkaz převzal jiný vědec.

V roce 1995 Venter oznámil svůj úspěch v úplném sekvenování bakteriálního genomu metodou náhodného sekvenování. Podobně tým soupeře o rok později oznámil sekvenci kvasinkového genomu.

V roce 2000 byl titul ukončen. Obě společnosti zveřejnily své předběžné výsledky celého genomu ve dvou nejprestižnějších vědeckých časopisech: Nature and Science.

Vědci však pokračovali v práci na zlepšování návrhů av roce 2006 byly dokončeny sekvence některých lidských chromozomů.

Význam a aplikace

Znalost pořadí nukleotidů tak důležité molekuly, jakou je DNA, je pro biology a příbuzné profesionály cenná. Tento řetězec polynukleotidů obsahuje všechny informace nezbytné pro vývoj a udržování všech forem života.

Z těchto důvodů je znalost této sekvence nezbytná pro biologický výzkum. Sekvenování v zásadě umožňuje měřit jednu z nejdůležitějších vlastností biologických systémů a stanovit rozdíly mezi nimi.

Sekvenování je široce používáno taxonomy a systematiky, protože určité sekvence DNA umožňují stanovit kritéria pro závěr, zda dva organismy patří ke stejnému druhu nebo ne, kromě toho, že jsou schopny navrhnout hypotézy o fylogenetických vztazích mezi nimi.

Kromě toho má sekvenování DNA aplikace v medicíně a diagnostice. Existují například levné a dostupné systémy, které pomocí sekvenování umožňují vyhodnotit tendenci k rozvoji určitých nemocí (jako je rakovina) pomocí takzvaných jednoduchých nukleotidových polymorfismů (SNP).

Vyšetřování kriminálního a forenzního typu byly obohaceny také sekvenčními technikami, které lze použít jako spolehlivý důkaz účasti určitého jednotlivce na trestném činu.

Reference

1. Heather, JM, & Chain, B. (2016). Sekvence sekvencerů: historie sekvenování DNA. Genomics, 107 (1), 1-8.
2. Koboldt, DC, Steinberg, KM, Larson, DE, Wilson, RK a Mardis, ER (2013). Sekvenční revoluce nové generace a její dopad na genomiku. Cell, 155 (1), 27-38.
3. Levy, J. (2010). Vědecké soupeření. Od projektu Galileo k projektu lidského genomu. Redakční Paraninfo.
4. Sanger, F., Nicklen, S. a Coulson, AR (1977). Sekvenování DNA s inhibitory zakončení řetězce. Sborník národní akademie věd, 74 (12), 5463-5467.
5. Schuster, SC (2007). Sekvenování nové generace transformuje dnešní biologii. Přírodní metody, 5 (1), 16.
6. Xu, J. (Ed.). (2014). Sekvenování nové generace. Caister Academic Press.