VOGES-PROSKAUERŮV TEST: ZALOŽENÍ, PŘÍPRAVA A POUŽITÍ - BIOLOGIE - 2025

Voges-Proskauerův test je biochemický testovací využívaná k identifikaci bakterie patřící do čeledi Enterobacteriaceae. Je to užitečné zejména pro odlišení kmenů Escherichia coli od Klebsiella a Enterobacter.

Test se provádí v kapalném kultivačním médiu zvaném Methyl Red - Voges Proskauer, lépe známém pod zkratkou RM / VP. Toto médium se skládá z pufrovaného polypeptidu, glukózy, fosforečnanu draselného a destilované vody.

Komerční médium Methyl Red-Voges Proskauer (RM / VP) pozitivní / negativní VP. Zdroj: Fotografie pořízená autorem MSc. Marielsa Gil / Sudipta.nov15, od Wikimedia Commons

Současné RM / VP médium je modifikace Clark a Lubsova média, které původně obsahovalo nižší koncentraci peptonů a glukózy. Tak se vyrobilo méně vodíkových iontů, které jsou potřebné pro pozitivní Voges-Proskauerovu reakci.

Test je založen na schopnosti mikroorganismu používat glukózu cestou butylen-glykolu a tvořit neutrální konečný produkt zvaný acetoin v přítomnosti kyslíku a alkalického pH.

V médiu RM / VP lze kromě odhalení testu Voges-Proskauer odhalit i test s methylovou červení.

Základ

Testovací základna Voges-Proskauer

Pluripeptony přítomné v médiu poskytují základní nutriční požadavky pro bakteriální růst. Glukóza je hlavní složkou. Mnoho bakterií má schopnost metabolizovat glukózu a vytvářet kyselinu pyruvovou.

Kyselina pyruvová je středem metabolismu glukózy a odtud se každý mikroorganismus může vydat různými cestami. Některé budou tvořit smíšené kyseliny, jako je kyselina mléčná, kyselina octová, kyselina mravenčí a kyselina jantarová, a jiné budou tvořit neutrální produkty, jako je 2,3-butandiol.

Test Voges-Proskauer odhaluje schopnost mikroorganismu tvořit acetylmethylkarbinol (acetoin), meziprodukt 2,3-butandiolu za aerobních podmínek.

Acetoin je redukován a tvoří 2,3-butandiol, ale tato reakce je reverzibilní, takže pokud se 2,3-butandiol oxiduje, vytvoří se acetoin. Proto je nezbytný kyslík.

Fosforečnan draselný je pufr, který pufruje směs při pH 6,9 ± 0,2.

Základ pro zveřejňování a interpretaci důkazů

Pro demonstraci reakce je třeba provést vývoj pomocí dvou činidel (Barritova činidla), známých jako Voges A a Voges B.

Voges A je 5% roztok a-naftolu a Voges B je 40% roztok hydroxidu draselného. Pokud není hydroxid draselný k dispozici, může být nahrazen 40% hydroxidem sodným.

Α-Naftol je katalyzátor, který zvýší intenzitu reakční barvy, čímž se test stane citlivějším. A-naftol musí být vždy přidán jako první, třepáním zkumavky tak, aby médium přicházelo do styku s kyslíkem. Tímto způsobem se přítomný acetoin oxiduje na diacetyl a 2,3-butandiol se oxiduje za vzniku acetoinu, který se vede na diacetyl.

Tímto způsobem se a-naftol váže na diacetyl, který se zase připojil k jádru guanidinu přítomnému v aminokyselině argininu, přičemž druhý z pluripeptonů.

Pro jeho část, draselný nebo hydroxid sodný, je zodpovědný za absorpci CO _2, a reakcí s peptony. Tato reakce způsobuje vznik lososově růžové barvy, která je dobře viditelná po velmi dobrém protřepání zkumavky.

Aby se barva okamžitě objevila, musí se smíchat správné množství diacetylu, peptonu a a-naftolu. Pokud k tomu nedojde, zkumavka se nechá před interpretací nechat 15 minut odpočívat.

Test je obvykle pozitivní po 2 až 5 minutách, kdy je vidět slabě růžová barva. Pokud ponecháte stát po dobu 30 minut až 1 hodiny, bude intenzita barvy maximální (intenzivní červená).

Negativní test se objeví, když vývar zžloutne. Po 1 hodině, je-li test negativní, může se v důsledku reakce hydroxidu draselného na a-naftol vytvořit měděná barva.

Příprava

Střední MR / VP

Naváží se 17 g dehydratovaného kultivačního média a rozpustí se v litru destilované vody. Nechte 5 minut stát. Zahřátím do varu se úplně rozpustí. Podávejte 3 až 4 ml ve zkumavkách a sterilizujte v autoklávu při 121 ° C po dobu 15 minut.

Dehydratované kultivační médium je béžové barvy a připravené médium je světle oranžové barvy.

Konečné pH média je 6,9 ​​± 0,2.

Vogesovo činidlo

Naváží se 5 g a-naftolu a rozpustí se v 50 ml ethylalkoholu (absolutně). Potom pokračujte v přidávání ethylalkoholu, dokud nedosáhne 100 ml.

Činidlo Voges B

Naváží se 40 g hydroxidu draselného a rozpustí se v kádince v 50 ml destilované vody. Sklo musí být umístěno do studené vodní lázně pro kontrolu teploty, protože když se přípravek rozpustí, teplota prudce stoupne.

Po vychladnutí se roztok převede do odměrné baňky a doplní se destilovanou vodou na 100 ml.

Postup zkoušky Voges-Proskauer

Pro provedení testu Voges-Proskauer se vývar RM / VP naočkuje studovaným mikroorganismem z čisté kultury po dobu 18 až 24 hodin.

Inokulum by nemělo být příliš husté. Inkubujte při 35–37 ° C po dobu 24 až 48 hodin, i když někdy je nutná inkubace po dobu několika dnů. Cowan a Steel jsou toho názoru, že 5 dnů je minimální inkubační doba nezbytná k detekci všech pozitivních druhů Voges-Proskauer (VP) z čeledi Enterobacteriaceae.

Vývoj testu

Oddělte alikvot o objemu 1 ml do zkumavky a vyvíjejte se následujícím způsobem: Umístěte 12 kapek (0,6 ml) činidla Voges A a 4 kapky (0,2 ml) Voges B. Promíchejte, aby se provzdušnil a nechal se usadit po dobu 5 - 10 minut před tlumočením. Pokud je však test stále negativní, nechte jej sedět a pozorujte zkumavku po 30 minutách až 1 hodině.

Vzhled narůžověle-červené barvy naznačuje, že Voges-Proskauerova reakce je pozitivní. Pokud médium zůstává žluté, reakce je negativní.

Aby se zabránilo falešným negativům, je nezbytné přidat vývojáře v uvedeném pořadí a množství.

Použití

Voges-Proskauerův test je užitečný pro rozlišení mezi kmeny E. coli, které jsou VP negativní, z rodů Klebsiella, Enterobacter, Serratia, mezi jinými, které jsou VP pozitivní.

Zdroj: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. ed. Editorial Panamericana SA Argentina.

QA

Kontrolní kmeny lze použít k testování kvality připraveného média, včetně Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium a Enterobacter cloacae ATCC 13047.

Očekávané výsledky jsou pozitivní Voges-Proskauerovy reakce pouze pro K. pneumoniae a E. cloacae. Zbytek dává negativní reakce.

Reference

1. Britannia Laboratories. MR-VP Medium. 2015.K dispozici na: www.britanialab.com
2. Microkit Laboratories. M-Ident Voges Proskauer. 2014. K dispozici:
3. Mac Faddin J. (2003). Biochemické testy pro identifikaci bakterií klinického významu. 3. ed. Editorial Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey a Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. ed. Editorial Panamericana SA Argentina.