BARVENÍ TOBOLEK: ZDŮVODNĚNÍ A TECHNIKY - BIOLOGIE - 2025

Barvení kapsle je diferenciální barvení technika, která má tu vlastnost, že stres polysacharidového struktury obklopující určité bakterie a kvasinky zvané kapsle. Používá se v klinických laboratořích k diagnostice určitých patologických stavů způsobených zapouzdřenými mikroorganismy.

Používá se také ve výuce laboratořích pro demonstraci této morfologické struktury studentům zdravotnických věd, jako jsou: medicína, bioanalýza, ošetřovatelství nebo cytotechnologie.

Klebsiella pneumoniae potřená skvrnou zbarvenou tobolkou. Indická inkoustová metoda s safraninem. Zdroj: А.А.В

Existuje několik jednoduchých technik, které demonstrují přítomnost tobolky v mikroorganismech, které ji mají. Jsou to: negativní skvrna, Anthony skvrna a varianta, která kombinuje předchozí dva.

Negativní barvení se používá hlavně ve vzorcích CSF, pokud existuje podezření na přítomnost kvasinek Cryptococcus neoformans. Tyto kvasinky jsou běžnou příčinou meningitidy.

Tato technika používá nigrosinový nebo indický inkoust a je založena na vytvoření kontrastu mezi pozadím přípravku a neproniknutelnou kapslí mikroorganismu. Pozadí ztmavne a tobolka je bezbarvá. Tímto způsobem je tato struktura odhalena.

Pokud jde o techniku ​​Anthony, lze říci, že se ve výukových laboratořích nejčastěji používá k prokázání polysacharidové struktury u bakterií, jako je Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae a Neisseria meningitidis.

Použití této techniky pro diagnostické účely je velmi vzácné, protože existují další rutinní testy, které umožňují identifikaci těchto mikroorganismů.

Základ

Tobolka je silná struktura polysacharidové povahy. To chrání mikroorganismy před fagocytózou, a proto je obtížné proniknout strukturou.

Proto jsou skvrny kapslí založeny na kontrastu. Barviva zabarví spodní část přípravku, zatímco kapsle zůstává bezbarvá.

Díky těmto technikám je kapsle snadno rozpoznatelná. Pokud mikroorganismus nemá kapsli, nebude u tohoto typu zbarvení rozlišitelný, protože vše bude obarveno stejnou barvou.

Všechny techniky použité k zabarvení tobolky mají stejné zdůvodnění i přes použití různých barviv a postupů.

Techniky par

-Anthony skvrna

Anthonyho skvrna používá krystalovou fialovou jako skvrnu. To zafarbí bakteriální tělo a pozadí fialové.

Na druhé straně se používá 20% síran měďnatý. To slouží jako promývací roztok, to znamená, že odstraňuje přebytek fialového krystalu z přípravku, čímž se kapsle čistí, ale bez bakteriálního těla nebo ztráty barvy pozadí.

materiály

- Duhové mléko.

- Skluzavka.

- 1% fialový krystal.

- 20% síran měďnatý.

- Optický mikroskop.

- Ponorný olej.

Proces

Tato technika se skládá z:

1. Mikroorganismus kultivujte v duhovém mléce po dobu 36 hodin.
2. Umístěte kapku kultury na konec sklíčka a vedle něj, umístěte kapku fialového skla, promíchejte a roztáhněte s koncem dalšího sklíčka.
3. Vysušte na vzduchu a nezasahujte.
4. Promyjte 20% roztokem síranu měďnatého, nechte uschnout na vzduchu.
5. Pozorujte pod mikroskopem s imerzním objektivem. Hledejte směrem ke koncům šíření.

Je důležité nepoužívat teplo ani k fixaci ani k vysušení, protože by to poškodilo kapsli. Také je nemyjte vodou.

Výklad

Iridescent mléko je vynikajícím kultivačním médiem, protože poskytuje nezbytné živiny pro mikroorganismy pro vývoj prominentní kapsle.

Na druhé straně, duhové mléko vytvoří silné a kompaktní dno, které bude obarveno fialově spolu s bakteriálním tělem, ale kapsle, která obklopuje mikroorganismus, zůstane bezbarvá. Proto je kolem bakteriálního těla pozorován jasný halo.

Grafické znázornění mikroskopického pozorování nátěru Klebsiella pneumoniae obarveného Anthonyho skvrnou. Zdroj: Autor autor MSc. Marielsa Gil.

Výhoda

Je to jednoduchá technika. Nevyžaduje opravu.

Rovněž je třeba poznamenat, že lze použít jiná kultivační média, ale mléčné médium je výhodné, protože má výhodu v tom, že poskytuje významnější kapsle.

Nevýhody

Je to poněkud náročnější technika než negativní barvení a její vizualizace vyžaduje čekání na úplné vyschnutí přípravku.

-Negativní barvení

materiály

- Posuňte snímky.

- Kultivační médium s mikroorganismem.

- Čínský inkoust nebo nigrosin.

- Optický mikroskop.

- Fyziologický solný roztok.

Proces

Položte kapku fyziologického roztoku na krycí sklíčko a rozpusťte malou část mikrobiální kultury. Je důležité, aby přípravek nebyl příliš silný. Poté vložte kapku čínského inkoustu nebo nigrosinu a promíchejte.

Na přípravek se potom položí krycí sklíčko bez přetékání kapaliny. Je pozorováno pod mikroskopem nejprve zaostřením na 10x objektiv a poté přesunem na 40X.

Tuto techniku ​​lze také použít přímo na vzorky CSF. To znamená, že místo umístění kapky mikrobiální kultury je umístěna kapka CSF.

Výhoda

Jedná se o jednoduchou metodu provedení a zároveň levnou. Nevyžaduje fixaci nebo sušení přípravku.

Nevýhody

Nevýhodou je, že musí být pozorován pod mikroskopem před vyschnutím přípravku, protože pokud k tomu dojde, mikroorganismy se zkrátí, což ztěžuje vizualizaci.

Na druhé straně může dojít k falešným pozitivům, pokud je analytik nezkušený, protože leukocyty jsou často zaměňovány s kvasinkami.

Pozorování kvasinkových tobolek čínskou inkoustovou nebo nigrosinovou technikou by mělo být považováno za předpokládanou diagnózu Cryptococcus neoformans, dokud není prokázána u kultury.

Je tomu tak proto, že existují další kvasinky, které by mohly být příčinou meningitidy, a nejen neoformany Cryptococcus, jako jsou ty z rodu Candida a Rhodotorula, jakož i další druhy Cryptococcus.

Výklad

Pokud jsou v kapslích mikroorganismy, bude pozorováno tmavé pozadí, s průhlednými těly plovoucími v kapalině, což zvýrazňuje přítomnost kapsle.

Cryptococcus neoformans tobolka obarvená čínským inkoustem. Zdroj: Fotografický kredit: Poskytovatelé obsahu: CDC / Dr. Leanor haley

- Indická inkoustová technika

Tuto techniku ​​lze také provést s nigrosinem. Jde o kombinaci dříve vysvětlených technik. Tato technika používá křišťálově fialovou a indickou barvu nebo nigrosin.

Bakteriální tělo změní barvu na křišťálovou fialovou, protože je negativně nabité, zatímco nigrosin zbarví spodní část nátěru. Pokud bakterie obsahuje tobolku, objeví se kolem mikroorganismu jako průhledný halo.

Křišťálovou violet lze nahradit kteroukoli z těchto barev: safranin, základní fuchsin nebo methylenová modrá.

materiály

- Fialové sklo.

- Nigrosin nebo indický inkoust.

- Posuňte snímky.

- Mikroskop.

Proces

- Kultivujte mikroorganismy v kultivačním médiu.

- Umístěte kapku kultury na konec sklíčka a vedle něj umístěte kapku indického inkoustu nebo krystalu nigrosinu, promíchejte a roztáhněte s koncem dalšího sklíčka.

- Suchý na vzduchu a nefixujte se na teplo.

- Zakryjte roztokem fialového krystalu po dobu 1 minuty, omyjte destilovanou vodou, ale velmi jemně (měkkým proudem), nechte zaschnout na čerstvém vzduchu.

- Pozorujte pod mikroskopem imerzní objektiv. Hledejte směrem ke koncům šíření.

Výklad

Bude vidět fialové bakteriální tělo a tmavé pozadí. Tobolka, pokud je přítomna, se objeví kolem bakterií bezbarvá.

Reference

1. Covadonga A, Silóniz M, Serrano S. Základní techniky mikrobiologie. Pozorování bakterií. Reduca (Biology). Mikrobiologická řada. 2010; 3 (5): 15-38. D
2. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas R. Základní skvrny v mikrobiologické laboratoři. Mediagraphic.org. 2014; 3 (1): 10-18. K dispozici na adrese: medigraphic.com
3. Gil M. Negativní barvení: zdůvodnění, technika, výhody a nevýhody. Lifeder.com.
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Argentina. Editorial Panamericana SA
5. Tankeshwar A. Capsule Stain: Princip, Postup a Výsledky. 2019. Medical Microbiology Guide. K dispozici v: microbeonline.com