WRIGHTOVA SKVRNA: ZDŮVODNĚNÍ, MATERIÁLY, TECHNIKA A POUŽITÍ - BIOLOGIE - 2025

Wright skvrna je barvení technika vytvořený americkou patologem James Homer Wright v roce 1902, na základě skvrnu Romanowského. Protože Romanowsky skvrna byla nestabilní, Wright začlenil methanol jako rozpouštědlo a fixační činidlo.

Toto zbarvení je polychromatické, což znamená, že vytváří několik barev v závislosti na struktuře absorbující barvivo. Tato barvicí technika se široce používá k provádění diferenciálního počtu bílých krvinek a ke studiu morfologie červených krvinek, krevních destiček a leukocytů v periferní krvi a kostní dřeni.

Různé skvrny periferní krve obarvené Wrightovou skvrnou. A. Akutní leukémie B. Plasmodium vivax uvnitř erytrocytů. C. Plasmodium falciparum, makrogametocyt. D. Lymfocyty

Jeho aplikace je velmi důležitá, protože abnormality lze pozorovat v různých buněčných liniích krve, což usnadňuje diagnostiku nemocí, jako je leukémie nebo bakteriální nebo parazitární infekce.

Možná se jedná o nejběžnější aplikace, ve kterých se tato technika používá, nejsou však jedinými. Je také užitečný ve vzorcích jiných než krev a kostní dřeň, jako je například výtok z nosu, fekální hlen, sputum, vzorky kůže.

Odůvodnění Wrightovy skvrny

Wrightova skvrna se narodila z Romanowského skvrny, která se skládá z roztoku methylalkoholu kyselého barviva (eosin Y) a zásaditého barviva (methylenová modrá) a jejich oxidačních produktů.

Směs barviv používaných ve Wrightově barvení způsobuje účinek známý jako Romanowsky, to znamená, že dává nádherné fialové zbarvení jádrům leukocytů a neutrofilních granulí, zatímco červené krvinky zbarví růžově.

Složky odpovědné za poskytnutí typické barevné škály Wrightova barvení jsou modrá B a eosin Y. Pozorovaný účinek bude záviset na vazbě barviv k chemickým strukturám a interakcím modré B a eosinu Y.

Kyselé struktury, jako jsou nukleové kyseliny, jaderné proteiny a reaktivní nezralá cytoplazma některých typů buněk, fixují modrou B (základní barvení).

Zatímco základní struktury, jako je hemoglobin, granule segmentovaných eosinofilů, kromě jiných buněčných struktur, vážou eosin Y (kyselé barvivo).

Výsledek barvení může být ovlivněn různými faktory, jako je například pH Wrightova barviva, pufr a promývací roztok; stejně jako doba zbarvení a fixace.

Proto je každý krok při přípravě činidel zásadní a musí být prováděn s ohledem na každý detail.

materiály

Wrightova skvrna. Pro 100 ml je nutné:

Naváží se 0,3 g Wrightova barviva, změří se 97 ml methanolu a 3 ml glycerolu.

Příprava

Do malty umístěte velké množství Wrightova barviva a postupně přidávejte glycerol, dokud se prášek úplně nerozpustí.

Následně se přidá methanol, smíchá se a nalije do jantarové láhve.

Před použitím by měl být roztok jemně protřepán a zfiltrován.

Pufrovaný pufrový roztok

V jednom litru destilované vody, 3,76 g dvojsodné soli hydrophosphate (Na ₂ HPO ₄ 2 H ₂ 0) a 2,1 g dihydrogenfosforečnanu draselného (KH ₂ PO ₄ se přidá).

Míchejte velmi dobře, dokud se všechna zabudovaná činidla nerozpustí. Upravte pH na 7,2. Nalijte do skleněné nádoby a udržujte při pokojové teplotě.

Další materiály potřebné k provedení zbarvení

Kromě toho jsou vyžadovány další materiály, aby byly schopny provádět barvicí techniku, jedná se o: sklíčka nebo kryty předmětů, obarvovací můstek, trička s vodou nebo pufrem pro praní, časovač pro udržení zbarvení a nějaký sušicí materiál (savý papír, gáza nebo bavlna).

Složky Wrightovy skvrny

Methanol

Alkohol (methanol) slouží jako fixace krevního nátěru na sklíčko.

Jde v zásadě o koagulační činidlo snižující, dehydratující a fixační. Jeho funkcí je proto koagulovat proteiny a učinit je nerozpustnými, ale bez jejich denaturace.

Metanol je nejrozšířenějším fixačním prostředkem ve všech laboratořích, protože poskytuje lepší výsledky než ethanol. Ideální koncentrace je 99%.

Tlumič

Pufr (pufrovaný roztok) má funkci nastavení nebo udržování pH barviva, protože pH upravené na 7,2 je nezbytné pro buněčnou strukturu, aby byla schopna barviva správně absorbovat.

Na druhé straně krok fixace metanolem dehydratuje buňky a pufr jim pomáhá rehydratovat je.

Eosin (Y)

Eosin má afinitu k stavebním blokům, protože se jedná o kyselé barvivo. Dva typy eosinu jsou navzájem velmi podobné, a to natolik, že je možné použít kterýkoli z nich a získat stejný výsledek.

Jeden se nazývá eosin Y, žlutý eosin nebo tetrabromofluorescein a druhý se nazývá eosin B, namodralý erythrosin B nebo dibromodinitrofluorescein. Nejčastěji se však používá eosin Y.

Nejdůležitější vlastností tohoto barviva je jeho negativní polarita, díky čemuž je přitahován k pozitivně nabitým buněčným strukturám.

Methylenová modř

Je to základní zbarvení. Jeho hlavní vlastností je metachromasie, to znamená, že ne všechny struktury budou obarveny stejnou barvou, záleží na chemickém složení struktur, které jsou obarveny.

Některé z nich změní barvu na světle nebo tmavě modrou a jiné na tmavě fialovou nebo světle fialovou.

Technika

1 - Proveďte rozprostření vzorku tak, aby zůstal tenký film, buď na sklíčku nebo na krycím sklíčku.

2-Nechte ho na vzduchu asi 2 hodiny uschnout.

3 Umístěte suchý nátěr na barvicí můstek nebo zásobník na barvení tak, aby vzorek směřoval nahoru.

4-List zakryjte skvrnou Wright po kapkách, dokud nebude celý povrch zakryt. Nechejte působit 5 - 8 minut.

5-Skvrna by měla zcela zakrýt sklíčko, aniž by se rozlila přes okraje. Pokud se během zbarvení začne odpařovat, přidejte několik dalších kapek.

6 - Následně přidejte stejné množství tlumiče nárazů, lehce foukejte, dokud se neobjeví charakteristický kovový lesk. Čas 10 až 15 minut.

7-Opláchněte vodou z vodovodu a jemný proud umístěte tak, aby list vypadal růžově.

8 - S gázou namočenou v alkoholu odstraňte barvivo ulpívající na zadní straně sklíčka.

9 - Nechte nátěr velmi dobře zaschnout před umístěním imerzního oleje, abyste si jej mohli prohlédnout pod mikroskopem.

Nástroj

Hematologie

Je ideální pro barvení nátěrů periferní krve, pro zkoumání hustých krevních nátěrů a pro studium buněk ze vzorků kostní dřeně.

Díky chemickým vlastnostem této kombinace barviv lze snadno rozeznat buněčné struktury a rozlišit různé typy přítomných buněk.

Rýma

Tato technika je velmi užitečná pro identifikaci buněk nosního výboje (epitelové buňky, segmentované eosinofily, polymorfonukleární buňky) při diagnostice alergické rýmy.

parazitologie

V tomto smyslu je užitečné pro studium Leishmania sp v histiocytech podkožní buněčné tkáně v kožních vředech. Podobně se používá k identifikaci leukocytů ve vzorcích stolice (fekální leukogram).

V tomto případě je zajímavé, aby lékař věděl, zda je leukocytóza přítomná ve stolici polymorfonukleární nebo mononukleární. Toto zjištění ve fekálním leukogramu povede, zda se jedná o bakteriální nebo virovou infekci.

Na druhé straně parazity cirkulující v krvi se nacházejí uvnitř erytrocytů nebo jsou volné v plazmě. Hledanými parazity jsou Plasmodium spp, Trypanosoma cruzii a filarias, a ve veterinární medicíně je užitečný při hledání Theileria equi a Babesia caballi, původců bebesiózy, zejména u koní.

Skvrna Wright a také skvrna Giemsa umožňují odlišit hemoparazity od normálních buněčných složek. K tomu lze použít dva typy pomazánek:

Spread tenký

Krev se šíří jako tenký film na sklíčku. Je obarveno Wrightovým barvením a odhaluje vlastnosti jádra a cytoplazmy.

Hustá kapka

Tato metodologie se používá ke zkoumání přítomnosti parazitů ve větším množství krve.

K tomu se na sklíčko umístí velká kapka krve. Jakmile je tam, musí být defibrilována a vytvářet větší a větší kruhy od středu směrem ven, pomocí okraje jiného skluzu.

Nakonec, aby bylo možné pozorovat parazity v hustém nátěru, musí být erytrocyty lyzovány vodou.

Respirační infekce

Na respirační úrovni je tato technika také užitečná, protože buňky přítomné ve vzorcích sputa, bronchiálního výplachu nebo bronchoalveolárního stavu jsou důležité pro stanovení diagnózy.

Podobně zde lze rozlišit polymorfonukleární buňky a mononukleární buňky.

Bakteriologie

Použití této techniky v bakteriologii je omezené, protože není dobré pro barvení bakterií, a proto se pro jejich barvení používají jiné specializované techniky barvení.

Používá se však k vyhledávání epiteliálních buněk s inkluzními těly Chlamydia trachomatis v nátěrech uretrálních nebo endocervikálních sliznic, ačkoliv je třeba uznat, že to není nejlepší metoda.

Je také možné pozorovat spirálovité bakterie, jako je Borrelia burgdorferi, u červených krvinek infikovaných pacientů, stejně jako morula nebo inkluzní tělíska Ehrlichia sp v cytoplazmě lymfocytů, monocytů nebo neutrofilů v krevním nátěru.

Mykologie

Histoplasma capsulatum je patogenní houba často diagnostikovaná mikroskopickým pozorováním různých vzorků tkáně, obarvená Wrightovým barvením.

Jak jsou pozorovány struktury vzorku krve s Wrightovou skvrnou?

Zdroj: Retamales E, Mazo V. Institut veřejného zdraví, vláda Chile. Doporučení pro barvení krevních nátěrů pro čtení hemogramu.

Doporučení pro dobré barvení

Sklíčka na vzorky krve by měla spontánně schnout na vzduchu. Roztěry by měly být co nejtenčí, aby se dosáhlo lepší fixace barviva a zabránilo se nadměrnému zabarvení.

Pro vysoce kvalitní barvení je vhodné barvit do dvou hodin od přípravy nátěru. Na druhé straně je ideálním vzorkem kapilární krev bez antikoagulantu.

Pokud se však použije žilní krev, měla by být použita jako antikoagulační EDTA a nikoli heparin, protože ten může deformovat buněčné struktury.

Aby se předešlo poškození připraveného barviva, mělo by být skladováno na suchém místě.

Během procesu praní se doporučuje používat vodu upravenou na neutrální pH.

Nakonec je vhodné čas od času otestovat metody barvení používané v laboratoři.

To se provádí barvením vzorků nebo rozšířených vzorů jako kontroly kvality. Tento krok je důležitý, protože zajišťuje, že barvení je správně připraveno a doba barvení je dobře standardizována.

Pokud je vzorový vzor špatně zbarvený, musí být vyřešeny problémy.

Časté chyby ve Wrightově barvení

Velmi světlé zbarvení

Velmi bledé nátěry jsou obvykle způsobeny velmi krátkou dobou zbarvení nebo nadměrným praním. Koriguje se prodloužením doby kontaktu s barvivem nebo zkrácením doby praní.

Sráží se barvivo

Přítomnost sraženin barviva v nátěru může mít několik příčin, nicméně nejčastější příčiny jsou: použití nefiltrovaného barviva, barvení na nerovnoměrných barvících můstcích, použití špinavých listů prachu nebo mastnoty, nemytí se dobře kompletní barvení.

Extrémně červený nebo modrý nátěr

Pufr je zodpovědný za pH barviva. Barviva s pH nižším, než je uvedeno (kyselé), budou mít za následek velmi načervenalé skvrny.

Pokud je pH barviva nad (zásadité), získá se extrémně namodralý nátěr.

Režim úložiště

Činidlo by mělo být skladováno při pokojové teplotě.

Reference

1. Gutiérrez V. Srovnávací studie mezi metodou Wrightova barvení a testem Elisa pro diagnostiku psí Ehrlichiózy ve městě San Pedro Sula v Hondurasu. 2008. Titul k získání titulu pro veterinární lékařství. Univerzita v San Carlos v Guatemale.
2. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Základní skvrny v mikrobiologické laboratoři. Výzkum zdravotního postižení. 2014; 3 (1): 10-18.
3. "Wrightova skvrna." Wikipedia, encyklopedie zdarma. 18. května 2018, 12:05 UTC. 8. prosince 2018, 20:37
4. Calderón A, Cardona J, Vergara Ó. Frekvence Babesia spp. v loveckých koních, Córdoba (Kolumbie). Rev. udcaactual divulg cient. 2013; 16 (2): 451-458.
5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Bailey a Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Argentina. Editorial Panamericana SA
6. Retamales E, Mazo V. Institut veřejného zdraví vlády Chile. Doporučení pro barvení krevních nátěrů pro čtení hemogramu.