ENDONUKLEÁZY: FUNKCE, TYPY A PŘÍKLADY - BIOLOGIE - 2025

Tyto endonukleázy jsou enzymy, které prochází fosfodiesterové vazby umístěné v nukleotidové řetězce. Endonukleázová restrikční místa jsou velmi rozmanitá. Některé z těchto enzymů štěpí DNA (kyselina deoxyribonukleová, náš genetický materiál) téměř kdekoli, tj. Nejsou nespecifické.

Naproti tomu existuje další skupina endonukleáz, které jsou velmi specifické v oblasti nebo sekvenci, která má být štěpena. Tato skupina enzymů je známá jako restrikční enzymy a jsou velmi užitečné v molekulární biologii. V této skupině máme známé enzymy Bam HI, Eco RI a Alu I.

Endonukleázy interně štěpily DNA.

Zdroj: pixabay.com

Na rozdíl od endonukleáz existují další typy katalytických proteinů - exonukleázy -, které jsou zodpovědné za rozbití fosfodiesterových vazeb na konci řetězce.

Restrikční endonukleázy

Restrikční endonukleázy nebo restrikční enzymy jsou katalytické proteiny, které jsou zodpovědné za štěpení fosfodiesterových vazeb uvnitř řetězce DNA ve velmi specifických sekvencích.

Tyto enzymy lze zakoupit od více biotechnologických společností a jejich použití je v současných technikách manipulace s DNA téměř nezbytné.

Restrikční endonukleázy jsou pojmenovány podle prvních písmen binomického vědeckého názvu organismu, ze kterého pocházejí, následuje kmen (to je volitelné) a končí skupinou restrikčních enzymů, ke kterým patří. Například Bam HI a EcoRI jsou široce používané endonukleázy.

Oblast DNA, kterou enzym rozpoznává, se nazývá restrikční místo a je jedinečná pro každou endonukleázu, i když se na restrikčních místech může shodovat několik enzymů. Toto místo se obecně skládá z krátké palindromické sekvence dlouhé asi 4 až 6 párů bází, jako je AGCT (pro Alu I) a GAATTC pro Eco RI.

Palindromické sekvence jsou sekvence, které, i když jsou čteny ve směru 5 'až 3' nebo 3 'až 5', jsou identické. Například v případě EcoRI je palindromická sekvence: GAATTC a CTTAAG.

Funkce a aplikace restrikčních endonukleů

Naštěstí pro molekulární biology bakterie v průběhu evoluce vyvinuly řadu restrikčních endonukleáz, které vnitřně fragmentují genetický materiál.

V přírodě se tyto enzymy vyvinuly - pravděpodobně - jako bakteriální ochranný systém proti invazi cizích molekul DNA, jako jsou například ty z fágů.

Aby bylo možné rozlišit mezi nativním a cizím genetickým materiálem, mohou tyto restrikční endonukleázy rozpoznávat specifické nukleotidové sekvence. DNA, která tuto sekvenci nemá, tedy může být uvnitř bakterie narušena.

Naopak, když endonukleáza rozpoznává restrikční místo, váže se na DNA a štěpí ji.

Biologové se zajímají o studium genetického materiálu živých věcí. DNA je však tvořena několika miliony párů bází. Tyto molekuly jsou extrémně dlouhé a musí být analyzovány v malých fragmentech.

K dosažení tohoto cíle jsou restrikční endonukleázy integrovány do různých protokolů molekulární biologie. Například, individuální gen může být zachycen a replikován pro budoucí analýzu. Tento proces se nazývá „klonování“ genu.

Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP)

Polymorfismy délky restrikčních fragmentů se vztahují k vzoru specifických nukleotidových sekvencí v DNA, které jsou restrikční endonukleázy schopné rozpoznávat a štěpit.

Díky specifičnosti enzymů je každý organismus charakterizován specifickým vzorem řezu v DNA, který pochází z fragmentů s různou délkou.

Druhy restrikčních endonukleáz

Historicky byly restrikční endonukleázy klasifikovány do tří typů enzymů, označených římskými číslicemi. Nedávno byl popsán čtvrtý typ endonukleázy.

Typ I

Nejdůležitější charakteristikou endonukleáz typu I je to, že se jedná o proteiny tvořené několika podjednotkami. Každá z těchto funkcí funguje jako jediný proteinový komplex a obvykle má dvě podjednotky nazývané R, dvě M a jedna S.

Část S je zodpovědná za rozpoznávání restrikčního místa v DNA. R podjednotka je nezbytná pro štěpení a M je zodpovědný za katalyzování methylační reakce.

Běžně se používají čtyři podkategorie enzymů typu I, známých písmeny A, B, C a D. Tato klasifikace je založena na genetické komplementaci.

Enzymy typu I byly první restrikční endonukleázy, které byly objeveny a purifikovány. Nejužitečnější v molekulární biologii jsou však typ II, který bude popsán v následující části.

Typ II

Restrikční endonukleázy typu II rozpoznávají specifické sekvence DNA a štěpení v konstantní poloze blízké sekvenci, která produkuje 5 'fosfáty a 3' hydroxyly. Jako kofaktory obvykle vyžadují ionty hořčíku (Mg ²⁺), ale existují i ​​některé, které mají mnohem konkrétnější požadavky.

Strukturálně se mohou objevit jako monomery, dimery nebo dokonce tetramery. Rekombinantní technologie používá endonukleázy typu II, a proto bylo charakterizováno více než 3 500 enzymů.

Typ III

Tyto enzymatické systémy se skládají ze dvou genů, které se nazývají mod a res, které kódují podjednotky, které rozpoznávají DNA, a modifikace nebo omezení. Obě podjednotky jsou nezbytné pro restrikci, což je proces zcela závislý na hydrolýze ATP.

Aby se štěpila molekula DNA, musí enzym interagovat se dvěma kopiemi nepalindromické rozpoznávací sekvence a místa musí být na substrátu v obrácené orientaci. Štěpení předchází translokace DNA.

Typ IV

V poslední době byla identifikována další skupina. Systém se skládá ze dvou nebo více genů, které kódují proteiny, které štěpí pouze modifikované sekvence DNA, buď methylované, hydroxymethylované nebo hydromethylované glukosyly.

Například enzym EckKMcrBC rozpoznává dva dinukleotidy obecné formy RmC; purin následovaný methylovaným cytosinem, který může být separován několika páry bází - od 40 do téměř 3000. Štěpení probíhá asi 30 párů bází po místě, které enzym rozpoznává.

Endonukleázy typu V

Endonukleázy tohoto typu jsou také známé jako "homing" endonukleázy. Tyto enzymy rozpoznávají a štěpí cílovou sekvenci DNA na jedinečných místech v genomu ze 14 na 40 bp.

Tyto enzymy jsou často kódovány v intronech a předpokládá se, že jejich funkcí je podpora horizontálního přenosu řezaných sekvencí. Po řezání dochází k dvojité šroubovice DNA na základě komplementární sekvence.

Příklady

Endonukleáza I z E. coli působí jako obranný systém proti fágu a parazitům. Nachází se hlavně mezi cytoplazmatickou membránou a buněčnou stěnou. Produkuje dvouvláknové zlomy v cizí DNA, se kterou interaguje v periplazmatickém prostoru.

Endonukleázy CRISPR-Cas jsou enzymy, které působí na obranný mechanismus mnoha typů bakterií. Tito identifikují a odříznou specifické DNA sekvence od napadajících organismů, které jsou obecně viry.

Vědci v Massachusetts Institute of Technology (MIT) nedávno objevili systém úpravy genomu CRISPR-Cas12bm s vysokou přesností pro úpravu lidských buněk.

Reference

1. Burrell, MM (ed.). (1993). Enzymy molekulární biologie. Totowa, NJ: Humana Press.
2. Loenen, WA, Dryden, DT, Raleigh, EA a Wilson, GG (2013). Restrikční enzymy typu I a jejich příbuzní. Nucleic acid Research, 42 (1), 20-44.
3. Murray, PR, Rosenthal, KS a Pfaller, MA (2017). Lékařská mikrobiologie + StudentConsult ve španělštině + StudentConsult. Elsevier Health Sciences.
4. Nathans, D., & Smith, HO (1975). Restrikční endonukleázy v analýze a restrukturalizaci molekul DNA. Roční přehled biochemie, 44 (1), 273-293.
5. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. a Wende, W. (2005). Restrikční endonukleázy typu II: struktura a mechanismus. Buněčné a molekulární vědy o životě, 62 (6), 685.