ORCEIN: ZALOŽENÍ A PŘÍPRAVA - CHEMIE - 2025

Orceína je v přírodní barvě fialové, extrahuje z různých lišejníků jako orchilla nebo archill, fruticose lišejník Rocella tinctoria a Lecanora Parella hlavně. Rocella tinctoria se nachází na africkém a americkém kontinentu, i když ji lze nahradit jinými druhy v Evropě.

Tato skvrna se v cytogenetických studiích používala od pradávna. V tomto smyslu byl přípravek orcein, který obsahuje kyselinu octovou, zaveden společností LaCourt v roce 1941, a proto byl původně nazýván technikou LaCourt.

Chemická struktura orceinu a roztoku orceinu. Zdroj: Wikipedia.org/ Oguenther na de.wikipedia (Dr. Guenther)

Stejně tak se díky své jednoduchosti a nízkým nákladům používá pro výrobu lakmusů (skvrna extrahovaná z lišejníků) a v histologických studiích (barvení buněk a tkání).

Několik studií použilo toto barvení v kombinaci s jinými chemikáliemi, jako je mikrokarbonát amoniaku a kyselina octová, k barvení elastických vláken a chromozomů. V současné době se orcein nadále používá v cytogenetických studiích zvířat a rostlin.

V poslední době Silva a kol. 2017 úspěšně použil tuto skvrnu k pozorování různých změn, ke kterým dochází v elastických vláknech kůže palce u chilských starších dospělých. Tato studie odhalila, jak se vlákna palce mění se stárnutím.

V tomto smyslu byla u jedinců starších 80 let pozorována elastická vlákna hnědočerné barvy; zatímco v nejmladších (od 60 let) jsou považovány za červenohnědé. Cytoplazma a další buněčné struktury se změní na žlutozelenou.

To umožnilo potvrdit přítomnost a stav elastických vláken z hlediska jejich dispozice, množství a integrity. Na druhé straně se také ukázalo, že orcein je mimo jiné velmi důležitý při identifikaci aneuryzmat a diagnostice arteritidy.

Základ

Orcein je součástí oxazinové skupiny barviv a barvení je založeno na jeho afinitě k DNA. Barvivo se váže na záporný náboj této molekuly, představovaný fosfátovou skupinou. Proto jsou chromozomy zbarveny nachově.

Ostatní struktury buněk však nabývají jiné barvy. Konkrétně v případě elastických vláken jsou zbarvena červenohnědá, buněčná jádra z modré na tmavě fialovou, zatímco kolagen se nezbarví.

Z tohoto důvodu se orcein používá k barvení chromatinu a diferenciaci sexu u některých druhů much. Podobně mohou být obarvena jádra a některé jaterní inkluze produkované antigeny hepatitidy B.

Roztoky orceinu mají při barvení specifické funkce. Orcein A má funkci změkčení buněčných membrán, způsobení jejich smrti a ochromení procesu jejich dělení. Mezitím je orcein B zodpovědný za dokončení barvení jeho přilnavostí k chromozomům.

Příprava

Aceto-orceinový roztok 1%

Při přípravě 1% roztoku aceto-orceinu se 2 g orceinu rozpustí ve 45 ml ledové kyseliny octové, s výhodou horké, a při teplotě místnosti se přidá 55 ml destilované vody.

Potom se neustále míchá, aby se roztok homogenizoval, aby se později nechal odpočívat, dokud vychladne. Nakonec se uchovává při 4 ° C v tmavých nádobách. Tento přípravek použil Flores 2012 k pozorování fází zrání kravských oocytů.

V tomto případě je například roztok aceto-orceinu umístěn na tkáň předem fixovanou v kyselině octové-ethanolu po dobu 24 hodin. Tento proces barvení se provádí po dobu 30 minut a tkáň se následně zbarví.

Rovněž jej lze použít při identifikaci organel v mnohobuněčných tkáních. V tomto případě je nátěr bukální sliznice obarven kapkou roztoku aceto-orceinu, krycí sklíčko je umístěno na sklíčko a jádro buňky se svými substrukturami může být okamžitě pozorováno.

Lacto-proponický roztok orcein 1%

Orcein může být navíc připraven s jinými chemikáliemi, jako je kyselina mléčná a kyselina propionová. Za tímto účelem se jeden gram orceinu rozpustí v předem smíchaném roztoku při pokojové teplotě 23 ml kyseliny mléčné a 23 ml kyseliny propionové; doplňte objem destilovanou vodou na 100 ml.

S tímto lakto-propionickým roztokem orceinu je možné pozorovat různé fáze meiotického dělení rostlinných buněk. V tomto případě se předem fixovaný a hydrolyzovaný vzorek umístí na 15 minut do lakto-propionického roztoku orceinu a poté se tkáň rozprostře na mikroskopická sklíčka.

Ve studii Duque 2016 o polygenních chromozomech použil přípravek 2 gramů orceinu zředěného v kyselině octové a 85% kyseliny mléčné, zředěný 65% roztokem kyseliny octové. Nakonec se podíval na chromozomy ve slinných žlázách Drosophila melanogaster.

Orcein A a Orcein B

Je důležité si uvědomit, že v závislosti na vzorku a na tom, co má být hodnoceno, je připraven vhodný roztok orceinu. Například k roztoku orceinu A se například přidá 1N kyselina chlorovodíková, aby se pozorovalo dělení buněk.

Zatímco roztok orceinu B je rozpuštěn v 45% kyselině octové. Tato technika je zkrácenou metodou barvení a obvykle se používá jako doplněk k barvení chromozomálních struktur.

Závěrečné myšlenky

Od minulých staletí se lišejníky jako Lecanora, Parmelia a Umbilicaria nacházejí v zemích amerického kontinentu, jako je Argentina, které jsou velkým zdrojem orceinu. Také evropské oblasti, jako jsou Kanárské ostrovy, byly v té době velkými producenty orchidejí.

Toto bylo vyváženo do jiných měst stejného kontinentu takový jako Janov a země takový jako Anglie, zatímco Holland monopolizoval výrobu lakmusového květu z orchilla. Proto byl tento lišejník později redukován, dokud nezanikl.

To vedlo k tomu, že byla orchidej nahrazena jinými rostlinami s vlastnostmi barviva. Výskyt syntetických barviv však přispěl k ukončení obchodu s tímto lišejníkem ze zdroje orceinu.

To bylo možné díky Cocqovi, který v roce 1812 popsal syntézu orceinu, protože věděl, že je syntetizován fenolickou sloučeninou zvanou orcinol. Navzdory tomu je dnes přírodní orcein stále preferovaný.

Může to být způsobeno tím, že orcinol je velmi silně vonící sloučenina a její dlouhodobá expozice by mohla mít zdravotní rizika, jako je ztráta schopnosti detekovat pachy. Tato poškození hypofýzy by mohla jít z dočasného do trvalého, čím větší bude expozice.

Reference

1. Ortega L, García R, Morales C. «Aplikace laku produkovaného houbami pro degradaci mikrobiologických barviv (orcein a křišťálově fialová).» Mladí lidé ve vědě 2. 2015; 633-637. K dispozici na adrese: jovenesenlaciencia.ugto.mx.
2. Barcat J. Orceína a Elastic Fibers. Medicine (Buenos Aires) 2003; 63: 453-456. K dispozici na: Medicinabuenosaires.com.
3. Silva J, Rojas M, Araya C, Villagra F. Histologické charakteristiky létající obličejové kůže palce u chilských jedinců s daktylogramovým vyblednutím. J. Morphol. 2017; 35 (3): 1107-1113. K dispozici na adrese: scielo.conicyt.
4. Orrillo M, Merideth B. „Reprodukční biologie brambor a cytogenetika.“ Mezinárodní centrum pro brambory (CIP). Technická příručka. K dispozici na adrese: research.cip.cgiar.org/
5. Flores F. «Sběr, kultivace a in vitro zrání kravských oocytů (bos taurus) v bolivijské vysočině.". Národní univerzita Altiplano, Puno-Peru; 2012. K dispozici na: repositorio.unap.edu.pe.
6. Duque C. Polytenické chromozomy: Pohled na jev endoreduplikace. Kolumbijská národní univerzita, Medellín; 2016. K dispozici na: edu.
7. Camarena F. Buněčná a molekulární biologie. Praktická příručka. Autonomní univerzita v Baja v Kalifornii. 2017. K dispozici na adrese: pez.ens.uabc.mx.
8. FAO / IAEA. 2018. Příručka k rozlišování divokých a chovaných much Anastrepha ludens (Loew) od normálního kmene („bi-sexuální“) a geneticky kmene (Tapachula-7), ozářené a nezářené. Guillen Aguilar JC, López Muñoz L, López Villalobos EF a Soto García DN Organizace spojených národů pro výživu a zemědělství. Řím, Itálie, 95 stran
9. Orcein. (2018, 30. listopadu). Wikipedia, encyklopedie zdarma. Datum konzultace: 03:38, 31. července 2019 es.wikipedia.org.
10. Merck Millipore. (2018, 16. července). Orceinová mikroskopie pro mikroskopii Certistain. K dispozici na adrese: merckmillipore.com