PROTEINÁZA K: CHARAKTERISTIKA, ENZYMATICKÁ AKTIVITA, APLIKACE - BIOLOGIE - 2025

K proteináza je enzym, který patří do skupiny serinových proteáz, tj, že má ve své střední katalyticky aktivní serinové aminokyselin a má funkci lámání peptidové vazby hydrolýzou. Tento enzym dále patří do rodiny subtilisinových proteinů (peptidáza S8).

Proteináza K má molekulovou hmotnost (MW) 28 900 daltonů a poprvé byla izolována v roce 1974 v extraktech houby Engyodontium album, dříve známé jako album Tritirachium Limber.

Molekulární struktura proteinázy K. Zdroj: Lykchiniadis

Má vysokou proteolytickou kapacitu, o čemž svědčí schopnost degradovat keratin přítomný ve vlasech. Slovo keratin v angličtině je hláskováno “keratin”, proto to bylo nazýváno “proteinase K”.

Díky své vysoké schopnosti štěpit nativní proteiny je tento enzym užitečný v různých technikách molekulární biologie. Primárně se používá k izolaci a přípravě nukleových kyselin s vysokou molekulovou hmotností (MW).

Proteináza K funguje tak, že uvolňuje jadernou DNA, zatímco ničí proteiny a inaktivuje RNázy a DNázy, to znamená, že eliminuje nukleázy v přípravcích DNA a RNA.

Na druhé straně bylo vidět, že proteináza K může hydrolyzovat některé denaturované nativní proteiny, což vzbudilo zájem vědců o její použití při studiu prionových proteinů (PrPC).

Nicméně, navzdory jejich vysoké proteolytické účinnosti, existují proteiny, které jsou rezistentní vůči působení proteinázy K. Mezi nimi jsou některé abnormální proteiny nazývané priony (PrPSc), spojené s přenosnými spongiformními encefalopatiemi.

Charakterizace proteinů K

Proteináza K má terciární strukturu tvořenou třemi vrstvami, přičemž mezi dvěma vrstvami helixů je vložen p-list se sedmi řetězci. Jelikož patří do rodiny peptidů S8, vyznačuje se tím, že má na svém aktivním místě katalytickou trojici, jejíž sekvenční pořadí je (Asp, His a Ser), které je odlišuje od ostatních rodin peptidáz.

Tento enzym ze skupiny serinových proteáz je charakterizován hydrolýzou peptidových vazeb blízkých karboxylové skupině alifatických a aromatických aminokyselin.

Na druhé straně je schopen působit v přítomnosti určitých žíravých látek, jako je dodecylsulfát sodný (SDS), Tris-HCL a EDTA, které se používají k denaturaci proteinů a způsobují jim ztrátu své přirozené struktury.

Toto je předběžný krok při přípravě proteinů pro elektroforézní techniku. Rozsah pH, ​​při kterém proteináza K působí, je poměrně široký (2,0 až 12,0), s optimálním pH mezi 7,5 až 12,0 a jeho isoelektrický bod je 8,9. Jak je vidět, je aktivní proti velmi širokému rozmezí pH.

Další charakteristikou, která vyniká v proteináze K, je její stabilita v přítomnosti vysokých teplot (50 - 60 ° C).

Enzymatická aktivita

Proteináza K vyžaduje přítomnost vápníkového iontu, ačkoli to nemá vliv na jeho aktivitu, je-li nezbytné udržet jeho stabilitu.

Aby proteináza K úplně strávila substrát, je nutná doba kontaktu přibližně 5 minut až 2 hodiny.

V tomto smyslu však Daza et al. Srovnal čistotu DNA získané v různých časech expozice proti proteináze K a dospěl k závěru, že prodloužená inkubace (až 24 hodin) významně zlepšuje kvalitu DNA.

Avšak ve vztahu ke koncentraci enzymu proteinázy K použitého v různých protokolech lze říci, že je velmi rozmanitý.

Může být použit od velmi nízkých koncentrací (5 µg / ml) do koncentrací 500 µg / ml. Nejběžnější pracovní koncentrace se však pohybují v rozmezí 50–100 μg / ml, zejména pro trávení bílkovin a inaktivaci nukleáz. I když pro ošetření tkání je nutná koncentrace 2 mg / ml.

Aplikace

Jeho aplikace jsou velmi široké a lze je shrnout takto:

- Používá se při trávení proteinů a extrakci DNA různými metodami, jako jsou: solení, PK-SDS, cetyl-trimethylamoniumbromid (CTAB), modifikovaný octan draselný a extrakce jodidem sodným.

- Inaktivace nukleáz (RNázy a DNázy).

-V in situ hybridizační technice (HIS), k podpoře uvolňování nukleových kyselin, kromě eliminace nežádoucích proteinů.

-Modifikace proteinů.

- Na úrovni výzkumu, v různých studiích.

Výhody proteinázy K

Bylo provedeno několik srovnávacích studií mezi technikami extrakce DNA, které používají proteinázu K, s jinými, které ji nepoužívají, a všechny dospěly k závěru, že při použití enzymu jsou větší výhody. Výhody zahrnují následující:

- získá se DNA s vysokou molekulovou hmotností, vysokou kvalitou a čistotou.

- Extrahovaná DNA je stabilní až 3 měsíce.

Extrahovaná DNA může být použita v následujících technikách: Southern blot, polymerázová řetězová reakce (PCR), elektroforéza, mimo jiné.

Proteináza K rezistentní proteiny

Různá výzkumy dospěly k závěru, že priony (abnormální toxické PrPSc proteiny) se liší od PrPC (nativních) proteinů tím, že jsou rezistentní vůči působení proteinázy K, zatímco PrPC jsou citlivé na její působení.

Jiní autoři popsali, že ve struktuře PrPSc jsou citlivé části a další rezistentní na proteinasu K. Obě části jsou však stejně toxické a infekční.

Na druhé straně Bastian et al. V roce 1987 izolovali 4 proteiny 28, 30, 66 a 76 kda z druhu Spiroplasma mirum. Bylo zjištěno, že všechny jsou rezistentní vůči působení proteinázy K a také měly zkříženou reakci s některými priony.

Je známo, že tento druh může způsobit šedý zákal a významné neurologické poškození a díky Bastianovým vědeckým poznatkům byl mimo jiné proveden pokus o propojení tohoto mikroorganismu s přenosnými spongiformními encefalopatiemi.

Etiologie této degenerativní neurologické patologie se však dnes přisuzuje prionům.

V tomto smyslu Butler et al. V roce 1991 identifikoval a charakterizoval třídu proteinů rezistentních na proteinázu K 40 kda ze dvou kmenů Mycoplasma hyorhinis. Tento patogen postihuje prasata a infikuje jejich tkáně, ale v tomto případě nedošlo ke zkřížené reakci s testovanými priony.

K objasnění mnoha neznámých je v tomto ohledu zapotřebí více výzkumu.

Reference

1. Bastian F, Jennings R a Gardner W. 1987. Antiserum na vláknitý protein spojený s klusavkou zkříženě reaguje s vláknitými proteiny Spiroplasma miru m. J. Clin. Microbiol. 25: 2430-2431.
2. Daza C, Guillen J, Rey J, Ruiz V. Hodnocení metody extrakce a čištění DNA z formaldehydem fixované svalové tkáně neidentifikovaných mrtvol. Med Magazine, 2014; 22 (1): 42-49,
3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E a Mcgarrity G. Identifikace a charakterizace proteinů K-rezistentních proteinů u členů třídy Mollicutes. Infection and Immunity, 1991, 59 (3): 1037-1042
4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L, et al. Srovnání dvou extrakčních protokolů Trypanosoma cruzi pěstovaných v axenickém médiu. Rev. Peru. Med. Exp. Public Health 2014; 31 (2): 222-227. K dispozici na adrese: scielo.org
5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E a Palma W. Stanovení účinnosti pěti protokolů extrakce DNA z parafinizovaného materiálu pro molekulární studie. Rev Méd Univ Costa Rica. 2007; 1 (1): 10-19.