KATALÁZOVÝ TEST: ZDŮVODNĚNÍ, TECHNIKA A POUŽITÍ - BIOLOGIE - 2025

Test kataláza je metoda používá v bakteriologických laboratořích odhalit přítomnost enzymu katalasy v těch bakterií, které ji mít. Spolu s Gramovým barvením jsou hlavními testy, které by měly být provedeny na nově izolovaných mikroorganismech. Tyto testy vedou mikrobiologa k tomu, jak postupovat při definitivní identifikaci daného mikroorganismu.

Obecně platí, že bakterie obsahující cytochrom mají enzym katalázu, což znamená, že by ji měly mít fakultativní aerobní a anaerobní bakterie. Existují však výjimky, jako například Streptococcus, které přestože jsou fakultativní anaerobní mikroorganismy, nemají enzym katalázu.

Provádění testu katalázy, což ukazuje pozitivní reakci. Zdroj: Nebyl poskytnut žádný strojově čitelný autor. Předpokládaná Nase (na základě nároků na autorská práva).

Proto se katalázový test používá především k rozlišení rodin Staphylococaceae a Micrococaceae (oba katalázy pozitivní) od rodiny Streptococaceae (kataláza negativní).

Stejně tak se mezi jinými odlišuje rod Bacillus (kataláza pozitivní) od rodu Clostridium (kataláza negativní).

Základ

Kataláza je enzym klasifikován jako hydroperoxidase, to znamená, že použití peroxidu vodíku (H ₂ O ₂) jako substrátu.

Rovněž se považuje za oxidoreduktázu, protože v reakci, kde se účastní, existuje prvek, který slouží jako donor elektronů (redukující látka) a druhý jako elektronový receptor (oxidující látka).

Kataláza je protein, který obsahuje proserickou skupinu se čtyřmi trojmocnými atomy železa (Fe ⁺⁺⁺), jedná se tedy o homoprotein. Železitý ion zůstává během reakce oxidován.

Dá se říci, že kataláza je detoxikační enzym, protože jeho funkcí je eliminace látek, které jsou produkovány během bakteriálního metabolismu, které jsou pro bakterie toxické. Mezi tyto látky patří peroxid vodíku.

Peroxid vodíku je tvořen aerobním rozkladem cukrů. K tomuto procesu dochází následovně:

Superoxidový iont (O ₂ ^-) (volný radikál) je tvořen jako konečný produkt asimilace glukózy aerobní cestou. To je toxické a je eliminováno enzymem superoxiddismutázou, která ji přeměňuje na plynný kyslík a peroxid vodíku.

Peroxid vodíku je také toxický pro bakterie a musí být odstraněn. Enzym kataláza rozkládá peroxid vodíku na vodu a kyslík.

Kataláza může působit na jiné substráty než peroxid vodíku, jako jsou alkoholy, aldehydy, kyseliny, aromatické aminy a fenoly. Peroxid vodíku však může být také použit katalázou k oxidaci jiných toxických sloučenin, jako je methyl a ethylalkohol.

Kataláza je také přítomna ve fagocytárních buňkách, chrání ji před toxickým působením peroxidu vodíku.

Rutinní technika pro katalázový test

-Slide metoda

materiály

3% peroxid vodíku (10 objemů).

Sklíčko mikroskopu

Jednorázová plastová rukojeť nebo dřevěný párátko.

Proces

Vezměte dostatek kolonie ke studiu, aniž byste se dotkli agaru, ze kterého vyšla. Kolonie musí být čerstvá, tj. Z kultury 18 až 24 hodin.

Umístěte kolonii na suchou snímku a přidat kapku 3% peroxidu vodíku k ní (30% H ₂ O ₂ může být také použit). Okamžitě sledujte, zda se uvolňují bubliny.

Výklad

Pozitivní reakce: vývoj plynu, o čemž svědčí tvorba bublin (silné probublávání).

Negativní reakce: bez tvorby bublin.

- Přímá metoda v čisté kultuře

Místo 1 ml 3% H ₂ O ₂ na čistě talíř nebo klínového kultury, které neobsahuje krev (s výhodou Živný agar). Sledujte, zda dochází okamžitě k tvorbě bublin. 30% H ₂ O ₂ mohou být také použity.

Je interpretován stejně jako metoda objektu porta.

-Metoda s kapilární trubicí nebo Fung a Petrishko

Naplňte kapilární zkumavku 67 mm do výšky 20 mm kapilárou 3% peroxidem vodíku.

Dotykem na izolované kolonie, které mají být studovány kapiláry naplněné s 3% H ₂ O ₂ . Pozorujte, zda se kapilára do 10 sekund naplní bublinami. Tato metoda umožňuje semikvantifikaci reakce na kříži:

Bez křížků nejsou žádné bubliny (negativní reakce).

+ ---- Několik bublin (slabá nebo opožděná reakce).

++ --– Bohaté bubliny (mírná reakce).

+++ - Čárky dosáhnou opačného konce (silná reakce).

- Taylorova a Achanzarova metoda pro katalázové testy, které vyvolávají pochybnosti

Umístěte izolované kolonie na čistou, suchou sklíčko, pak místo kapku 0,5% H ₂ O ₂ a krytem s krycím sklíčkem. Sledujte, zda se vytvářejí zachycené bubliny.

Interpretace: přítomnost bublin naznačuje pozitivní reakci. Žádné bubliny, je to interpretováno jako negativní reakce.

Katalázový test na druhy Mycobacterium

Tuto techniku ​​je třeba provést kontrolou pH a teploty. Musí se provádět pod laminárním krytem toku, protože manipulace s různými druhy Mycobacterium je nebezpečná.

-Materiály

Peroxid vodíku 30% nebo 110 objemů (superoxal).

Fosfátový pufr pH 7

10% Tween 80

Kultivace klínovým mykobakteriem po dobu 3 až 4 týdnů

-Příprava

Fosfátový pufr pH 7

Vážit:

1,361 g z bezvodého fosforečnanu monodraselného (KH ₂ PO ₄).

1,420 g bezvodého hydrogenfosforečnanu sodného (Na2HP03).

Obě soli se rozpustí v malé sterilní destilované vodě a doplní se vodou na 1000 ml.

10% Tween 80

Proveďte ředění 1:10 na Tween 80, který je komerčně koncentrován, a to následujícím způsobem:

Vezměte 1 ml Tween 80 a vložte jej do trochu destilované vody, rozpusťte a poté doplňte objem vodou na 10 ml.

Konečné činidlo

Smíchejte množství fosfátového pufru s množstvím 10% Tween 80 (stejné díly). Definujte v laboratoři, kolik chcete připravit.

-Proces

Vložte 5 ml fosfátového pufru do sterilní zkumavky s uzavřeným šroubem (Bakelite).

Pomocí očkovací smyčky vezměte dostatek kolonií růstu Mycobacterium naočkovaných do klínů a rozpusťte ve fosfátovém pufru.

Zkumavku uzavřete, aniž by se příliš dotáhla nit. Umístí se na 20 až 30 minut do vodní lázně při 68 ° C. Vyjměte a nechte vychladnout na 22-25 ° C

Změří se 0,5 ml konečného činidla (promíchá se) a přidá se do zkumavky se studeným roztokem. Sledujte vznik bublin nebo ne.

Je interpretován stejně jako předchozí techniky.

Použití

Pokud se v obohacených médiích dosáhne růstu kolonií, mělo by se na získaných koloniích provést Gramovo barvení a katalázový test. To povede mikrobiologa k postupům, které je třeba dodržovat při konečné identifikaci.

Zdroj: Připravil autor MSc. Marielsa gil

QA

Pro hodnocení dobré výkonnosti peroxidu vodíku použijte čerstvě kultivované kontrolní kmeny, jako je Staphylococcus aureus jako pozitivní kontrolu, a kmeny Streptococcus sp jako negativní kontrolu.

Další alternativou, která slouží jako pozitivní kontrola, je umístit kapku peroxidu vodíku na krevní agar, erytrocyty mají katalázu, takže pokud bude činidlo v dobrém stavu, probublává.

Jako negativní kontrolu lze použít čokoládový agar, kde jsou erytrocyty již lyžovány a test je negativní.

Omezení

- Nepoužívejte pro test staré kultury, protože to může způsobit falešné negativy.

- Vyvarujte se odebírání kolonií z kultur na krevním agaru, pokud jste opatrní, abyste se nedotkli agaru; Tento postup může vést k falešným pozitivům, protože červené krvinky obsahují katalázu.

-Pokud berete kolonii s platinovou rukojetí, neměňte pořadí procedur, protože to může vést k falešným pozitivům. Důvodem je to, že platina je schopna reagovat s peroxidem vodíku, což způsobuje bublání.

- Nepoužívejte peroxid vodíku, je-li velmi staré, protože je velmi nestabilní a má tendenci se časem rozkládat.

-Udržujte peroxid vodíku chráněný před světlem a chlazený, aby nedošlo k poškození.

- Při každém použití proveďte kontrolu kvality peroxidu vodíku.

Take v úvahu, že v případě 30% H ₂ O ₂ se používá, reakce jsou silnější než ty, které provádí s 3% H ₂ O ₂.

Reference

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey a Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
3. Mac Faddin J. (2003). Biochemické testy pro identifikaci bakterií klinického významu. 3. ed. Editorial Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
4. Laboratoře BD. Činidlo Catalase-Gotario. K dispozici na adrese:
5. Vadequímica Laboratories. Peroxid. Rovnocennost mezi objemy a procentem. K dispozici na adrese: vadequimica.com