GRAMOVO BARVENÍ: ZDŮVODNĚNÍ, MATERIÁLY, TECHNIKA A POUŽITÍ - BIOLOGIE - 2025

Gramovo barvení je nejjednodušší a nejužitečnější barvení technika v diagnostické mikrobiologie. Tuto techniku ​​vytvořil dánský lékař Hans Christian Gram v roce 1884, kterému se podařilo podle složení buněčné stěny klasifikovat bakterie jako grampozitivní a grampozitivní.

Tato technika prošla v roce 1921 určitými úpravami Huckerem, aby stabilizovala činidla a zlepšila kvalitu barvení, což je důvod, proč je Gramovo barvení známé také jako Gram-Hucker.

Různé skvrny obarvené Gramovým sklem. A. Gram pozitivní koky. B. Gram negativní tyče. C. Grampozitivní, polymorfonukleární a mononukleární bacily. D. Kvasinky.

S touto technikou je také možné pozorovat tvar mikroorganismů, tj. Pokud jsou koky, bacily, kokobacily, pleomorfní, vláknité. Stejně jako jeho distribuce v prostoru: v klastru, v řetězci, izolované, v párech, v tetradech atd.

Pokud je podezření na bakteriální infekci, většina získaných vzorků by měla být potřena na sklíčku a Gram obarvena pro mikroskopické vyšetření.

Gramova zpráva povede lékaře, jaký typ mikroorganismu může být příčinou infekce, než získá konečný výsledek kultivace.

V některých případech je život pacienta velmi ohrožen, proto lékaři naléhavě potřebují Gramovu zprávu, aby provedli empirickou léčbu, zatímco čekají na identifikaci mikroorganismu.

Například, pokud Gram odhalí, že v mozkomíšním moku existují grampozitivní koky, lékař provede úvodní terapii antibiotiky, která vylučují tento typ bakterií, podle protokolů k tomu stanovených.

Jakmile konečný výsledek přijde s názvem izolovaného mikroorganismu a jeho příslušného antibiogramu, lékař vyhodnotí, zda změnit terapii. Toto rozhodnutí bude učiněno na základě studie citlivosti mikroorganismu na antibiotika, která přijímá, a vývoje pacienta.

Základ

Jedná se o techniku, která má 4 základní kroky: barvení, fixaci mořidlem, změnu barvy a kontrastní barvení. Tato technika tedy kromě barvení bakterií také umožňuje jejich diferenciaci.

Křišťálová violeť je první použité barvivo. Má afinitu k peptidoglykanu a obarví všechny přítomné bakterie fialové, následně se umístí lugol, který působí jako mordant, to znamená, že indukuje tvorbu nerozpustných krystalických violet-jódových komplexů - ribonukleárních proteinů v buňce..

Grampozitivní bakterie, které mají silnou stěnu peptidoglykanu, vytvářejí více komplexů (křišťálově fialový-jód), proto si zachovávají barvivo.

Kromě toho také ovlivňuje, že stěna grampozitivních bakterií obsahuje větší množství nenasycených kyselin, které vykazují velkou afinitu k oxidačním činidlům (Lugol).

Mezitím mají gramnegativní bakterie tenkou vrstvu peptidoglykanu, což způsobuje, že bakterie tvoří méně komplexů než grampozitivní.

Pak následuje krok zabarvení, kde se grampozitivní a grampozitivní bakterie chovají odlišně.

Gram negativní bakterie obsahují vnější membránu bohatou na lipopolysacharidy, která je součástí jejich buněčné stěny. Tuky jsou ničeny kontaktem s acetonalkoholem, takže vnější membrána se destabilizuje a uvolňuje fialový krystal.

To je, jak se tomu pak potýká s safraninem nebo základním fuchsinem, který zčervená.

V případě grampozitivních bakterií odolávají vyblednutí, protože bělidlo funguje uzavřením pórů, což zabraňuje úniku krystalického violeta / jodu.

Proto zbarvení křišťálovou violetou zůstává stabilní a není zde žádný prostor pro safranin nebo fuchsin. To je důvod, proč tyto bakterie skvrny tmavě modré nebo fialové.

materiály

Gramova barvicí sada se skládá z:

• Fialové sklo
• Lugol
• Aceton alkohol
• Safranin nebo základní fuchsin

Příprava barviv a činidel

Křišťálově fialový roztok

Řešení:

Fialový krystal ------------- 2 gr

Ethylalkohol 95% ----------- 20cc

Řešení B:

Oxalát amonný ----------- 0,8 g

Destilovaná voda ------------- 80 cm3

Pro konečnou přípravu křišťálově fialové musí být roztok A zředěn 1:10 destilovanou vodou a smíchán se 4 díly roztoku B. Směs je před použitím skladována 24 hodin. Filtrujte do jantarové barvicí láhve pomocí filtračního papíru.

Množství, které se má denně použít, se převede do jantarové kapací láhve.

Iodo-Lugol

Odvážte a změřte uvedené množství každé sloučeniny takto:

Jodové krystaly ------------- 1gr

Jodid draselný ------------- 2gr

Destilovaná voda ------------- 300 cm3

Jodid draselný se ve vodě rozpustí postupně a poté se přidá jód. Roztok se oholí do jantarové láhve.

Množství, které se má denně použít, se převádí do menší jantarové láhve s kapátkem.

Bělení

95% ethylalkohol -----------– 50 ml

Aceton ------------------ 50 ml

Je připraven ve stejných částech. Zakryjte dobře, protože má tendenci se odpařovat.

Umístěte do kapací láhve.

Tento přípravek poskytuje změnu barvy v mírném čase 5 až 10 sekund a je nejvíce doporučovaný.

Začátečníci dávají přednost použití pouze 95% ethylalkoholu, kde blednutí je pomalejší než 10 až 30 sekund.

Zatímco zkušenější mohou používat čistý aceton, kde dochází k velmi rychlé změně zbarvení od 1 do 5 sekund.

Kontrast

Zásobní roztok safraninu

Safranina -------------– 2,5 g

Ethylalkohol 95% --------– 100 cm3

Po zvážení uvedeného množství safraninu se rozpustí ve 100 ml 95% ethylalkoholu.

Pracovní roztok safraninu se připravuje ze zásobního roztoku.

Za tímto účelem změřte 10 cm3 zásobního roztoku, přidejte 90 ml destilované vody, aby se vytvořilo 100 ml.

Doporučuje se převést množství, které se má denně použít, do jantarové láhve s kapátkem.

Mikroorganismy, které slabě barví Gram-negativní pomocí Gram-Huckerovy skvrny, jako jsou určité anaeroby, Legionella sp, Campylobacter sp a Brucella sp, mohou být značeny mnohem lépe pomocí Kopeloffovy modifikace Gram-Huckerovy skvrny, nazývá se Gram-Kopeloffova skvrna.

Tato technika mění safraninové barvivo na základní fuchsin. Touto úpravou je možné účinně obarvit výše uvedené mikroorganismy.

Skladování reagencií

Připravená barviva by měla být skladována při pokojové teplotě.

Příprava nátěru vzorku, který má být zbarven

Vzorek musí obsahovat alespoň 10 ⁵ mikroorganismů před pozorováním mikroorganismu v nátěru je pravděpodobné. Roztěry mohou být vyrobeny z přímého vzorku nebo z kultur v pevném nebo kapalném médiu.

Pro lepší vizualizaci přítomných struktur by měly být nátěry jednotné, dobře rozložené a ne příliš silné.

-Gram přímých vzorků

Gram necentrifugované moči

Moč je smíchána a na sklíčko je umístěno 10 ul. Pozorování alespoň jedné bakterie / dip pole naznačuje, že existuje infekce.

Znamená to, že se kultura bude mít přibližně více než 100.000 CFU / ml (10 ⁵ CFU / ml) moči v 85% případů.

Tato metoda není užitečná pro počty kolonií pod 100 000 CFU.

Gram CSF

CSF by měl být odstředěn, supernatant odstraněn a peleta rozprostřena na sklíčku. Tato kapalina je za normálních podmínek sterilní; pozorování bakterií indikuje infekci.

Gram vzorků dýchacích cest

Gram ve sputu, bronchiálním nebo bronchoalveolárním výplachu, i když může existovat celá řada mikroorganismů, bude vždy řídit diagnózu, kromě toho, že bude užitečný typ pozorovaných buněk.

V případě sputa by měl být nátěr připraven s nejvíce purulentními částmi vzorku.

Gram stolice

U tohoto typu vzorků se nedoporučuje provádět Gram, protože nemá žádnou diagnostickou hodnotu.

-Gram plodin

Mohou být provedeny dvěma způsoby, jeden z tekutých kultur a druhý z pevných kultur.

Kapalné kultury

Z tekutých kultur je to velmi jednoduché; Několik hořek zakaleného vývaru je odebráno pod hořákem a umístěno na čisté a suché sklíčko, provádějící kruhové pohyby od středu směrem k periferii, aby se materiál rovnoměrně rozložil.

Nechte ho samovolně vyschnout na vzduchu. Po zaschnutí je materiál fixován k archu teplem. K tomu se pomocí pinzety list nechá projít 3 až 4 krát plamenem Bunsenova hořáku, přičemž dbejte na to, aby nedošlo k spálení materiálu.

Plech se nechá vychladnout a umístí se na barvicí můstek.

Pevné plodiny

Chcete-li provést skvrnu pro Gramovo barvení z pevné kultury, postupujte takto:

Před výběrem kolonií, které mají být odebrány, by se mělo připravit sklíčko, do kterého se vloží přibližně dvě kapky sterilního fyziologického roztoku.

Pokud původní kultivační destička obsahuje několik různých typů kolonií, vybere se pro provedení gramu izolovaná kolonie každé. Každá kolonie bude odebrána s platinovou smyčkou, aby se rozpustila ve fyziologickém roztoku, který byl předtím umístěn na sklíčko.

Kruhové pohyby se provádějí od středu směrem k periferii, aby se kolonie na sklíčku rovnoměrně rozložila.

Nechte ho samovolně vyschnout na vzduchu. Po zaschnutí je fólie fixována teplem, jak bylo vysvětleno výše (plamenem skluzu zapalovačem), dávejte pozor, abyste materiál nespálili.

Tento postup musí být proveden s každým jiným typem kolonie. Na kus papíru by mělo být uvedeno pořadí toho, co je pozorováno, například:

Kolonie 1: Beta-hemolytická žlutá kolonie: Ve shlucích byly pozorovány grampozitivní koky

Kolonie 2: Krémově zbarvená kolonie bez hemolýzy: Byly pozorovány gramnegativní kokobacily.

Každý snímek musí být označen, abychom věděli, co pozorujeme.

Technika

Technika barvení podle Grama je velmi snadno proveditelná a relativně levná a nelze ji v mikrobiologické laboratoři vynechat.

To se provádí takto:

1. Opravte nátěr teplem a umístěte ho na barvicí můstek.
2. Sklíčko úplně zakryjte krystalovou fialovou na 1 minutu.
3. Omyjte vodou Nesušte
4. Zakryjte plachtou roztokem na koleno a nechte působit 1 minutu. Omyjte vodou Nesušte.
5. Bělte po dobu 5-10 sekund za mírného protřepávání v acetonu alkoholu. Nebo položte fólii do svislé polohy a kapky odbarvovače položte na povrch, dokud se neodstraní přebytek nezbarveného fialového skla. Nepřekračujte.
6. Omyjte vodou Nesušte.
7. Vyměňte sklíčko na barvícím můstku a přikryjte po dobu 30 sekund safraninem (Gram-Hucker) nebo 1 min základním fuchsinem (Gram-Kopeloff).
8. Omyjte vodou
9. Nechte ho samovolně vyschnout ve svislé poloze.

Po zaschnutí umístěte 1 kapku imerzního oleje, abyste ji pozorovali pod objektivem 100X ve světelném mikroskopu.

Nástroj

Tato technika umožňuje rozlišit morfotintoriální rozdíly většiny bakterií.

Kvasinky se také vyznačují tímto zbarvením. Křišťálovou fialovou berou, to znamená, že barví Gram pozitivně.

Na druhé straně lze rozlišit grampozitivní bacily vytvářející spóry, ve kterých je uvnitř bacilu pozorován volný prostor, kde se vytvořil endospor, i když spóry se dobře nezbarvují. K barvení spór se používají jiné techniky, jako je Shaeffer-Fulton.

Je třeba poznamenat, že toto barvení se nepoužívá k barvení všech typů bakterií, to znamená, že existují případy, kdy barvení nefunguje.

V tomto případě lze uvést bakterie bez buněčné stěny. Například: rod Mycoplasma, sfheroplasty, ureaplasma, L-formy a protoplasty.

Velmi špatně také obarví bakterie stěnami bohatými na kyseliny mykolové, jako jsou Mycobacteria, a intracelulárními bakteriemi, jako jsou Chlamydias a Rickettsias.

Je také neúčinná při barvení většiny spirochetálních bakterií.

Existují bakterie stejného rodu, které lze pozorovat ve stejném vzorku jako grampozitivní a grampozitivní. Když k tomu dojde, nazývá se to variabilní Gramovo barvení, které může být způsobeno změnou živin, teploty, pH nebo koncentrace elektrolytu.

Obyčejné chyby

Přehnané bělení

Přehnané vybarvení může vést k pozorování falešných gramnegativních mikroorganismů.

Nečekejte dostatečně dlouhou dobu sušení, abyste přidali ponorný olej

To může způsobit grampozitivním bakteriím, aby zabarvily gramnegativní (falešně gramnegativní). To se děje proto, že ve starých kulturách jsou pravděpodobně mrtvé nebo zkažené bakterie a za těchto podmínek si bakterie neudržují křišťálovou fialovou.

Použijte velmi staré řešení lugol:

V průběhu času ztrácí lugol své vlastnosti a jeho barva mizí. Pokud se použije již degenerované činidlo, nebude krystalová violeť dobře fixována, proto existuje možnost získat vizualizaci falešně gramnegativních mikroorganismů.

Modré pozadí

Správně zbarvené pozadí bude červené. Modré pozadí znamená, že zbarvení bylo nedostatečné.

Reference

1. Ryan KJ, Ray C. 2010. Sherris. Medical Microbiology, 6. vydání McGraw-Hill, New York, USA
2. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. (5. vydání). Argentina, Editorial Panamericana SA
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Argentina. Editorial Panamericana SA
4. Casas-Rincón G. 1994. Obecná mykologie. 2. ed., Centrální univerzita Venezuela, edice knihoven. Venezuela Caracas.
5. "Gramová skvrna." Wikipedia, encyklopedie zdarma. 4. října 2018, 23:40 UTC. 9. prosince 2018, 17:11. Převzato z es.wikipedia.org.
6. González M, González N. 2011. Manuál lékařské mikrobiologie. 2. vydání, Venezuela: Ředitelství médií a publikací z University of Carabobo.
7. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Základní skvrny v mikrobiologické laboratoři. Výzkum zdravotního postižení. 2014; 3 (1): 10-18.