BARVENÍ HEMATOXYLÍNU-EOSINU: VLASTNOSTI, POUŽITÍ, TECHNIKY - CHEMIE - 2025

Hematoxylin - eosinem je barvení technika využívající kombinaci barviv hematoxylinem a eosinem. Tato dvojice barviv tvoří dokonalé duo, protože hematoxylin působí jako základní barvivo a eosin je kyselé barvivo.

Označení bazických nebo kyselých barviv se netýká pH získaného v roztoku, ale spíše hovoří o převládajícím podílu, pokud jde o aniontové nebo kationtové náboje, které mají, nebo podle umístění chromoforové skupiny.

Hematoxylin - eosin (HE) obarvený ciliární sloupcový epitel Zdroj: Todd Straus a Vladimir Osipov

V tomto smyslu je hematoxylin považován za základní (kationtové) barvivo, a proto má afinitu k kyselým strukturám, jako je jádro buněk. Zatímco eosin, který je kyselým (aniontovým) barvivem, má afinitu k alkalickým nebo zásaditým strukturám, jako je buněčná cytoplazma.

Z tohoto důvodu je tato kombinace barviv široce používána pro barvení tkáně, protože umožňuje jasné rozlišení jader a cytoplazmů. Jádra zbarvují tmavě modrou nebo fialovou a cytoplazma růžovou.

Hematoxylin-eosinové barvení je jednou z nejpoužívanějších technik barvení v oblasti histologie a cytologie díky své snadné manipulaci a nízkým nákladům. Používá se mimo jiné k vizualizaci buněk, hustých nervových vláken a přítomnosti určitých mikroorganismů v tkáních, jako jsou: paraziti, houby a bakterie.

vlastnosti

Hematoxylin

Hematoxylin je neutrální barvivo. Složka poskytující barvu (chromofor) se však nachází v kationtovém nebo základním středu molekuly. Proto je jeho afinita k kyselým strukturám. Jeho chemický vzorec je C ₁₆ H ₁₄ O ₆ a jeho vědecký název je 7,11b-dihydroindeno chromen-3, 4,6a, 9,10 (6 H) -pentol.

Zabarvuje hlavně jádra buněk, protože jsou velmi bohaté na nukleové kyseliny. Může také barvit cytoplazmatické inkluze virového původu.

Aby se hematoxylin zbarvil, musí být v oxidovaném stavu a vázán na kov. Ten bude sloužit k fixaci na tkáň, to znamená, že bude působit jako mordant.

Když je hematoxylin oxidován, nazývá se hematein. Oxidace se dosáhne vystavením kyslíku (stárnutí) činidla nebo látkami, které pomáhají jeho oxidaci (chemická oxidace).

Eosin

Eosin je barvivo, které zbarví červeně nebo růžově. Je nerozpustný ve vodě, i když existuje verze rozpustná ve vodě. Obecně se eosin připravuje rozpuštěním v alkoholu (95 ° ethanol).

Barví cytoplazmy, svalová vlákna, cytoplazmatické organely a kolagen, ale nebarví buněčná jádra. Je to proto, že je záporně nabitá, a proto má afinitu k pozitivně nabitým strukturám.

Existují dva typy eosinu „Y“ a „B“. Eosin "Y" je známý jako žlutý eosin. Jeho vědecký název je tetrabromo ores uorescein a jeho chemický vzorec je C ₂₀ H ₈ Br ₄ O ₅.

Na druhé straně se eosin "B" někdy nazývá namodralým erytrosinem B. Jeho vědecký název je dibromodynitro ores uorescein a vzorec je C ₂₀ H ₈ Br ₂ N ₂ O ₉. Oba jsou velmi podobné a rozdíl mezi používáním jednoho nebo druhého není opravdu patrný. Nejoblíbenější je však eosin „Y“.

Eosin má schopnost rozlišovat mezi živou buňkou a mrtvou, protože je schopna procházet membránou a obarvit svou cytoplazmu, když jsou buňky mrtvé, takže cytoplazma buňky zůstane bezbarvá, pokud zůstane naživu.

Aplikace

Barvení nervových vláken

Silná nervová vlákna mohou být obarvena a identifikována hematoxylin-eosinem. To však není užitečné pro barvení tenkých nervových vláken, protože k jejich vizualizaci je zapotřebí stříbrného zbarvení.

Histologické skvrny na kůži

Při barvení nadržené vrstvy kůže je barvivo, které působí, eosin, protože na této úrovni buňky nemají jádro.

V granulární vrstvě kůže hematoxylin silně barví granule keratohyalinu uvnitř buněk granulí. Naopak spinální vrstva kůže je slabě obarvena hematoxylínem, zatímco bazální nebo zárodečná vrstva je zcela obarvená.

Eosin barví cytoplazmu všech buněk a intenzita barvy se může lišit od vrstvy k vrstvě.

Hematoxylin-eosinové barvení vzorků stolice

Gómez et al., V roce 2005 prokázalo, že barvení hematoxylínu-eosinu bylo účinnější při identifikaci případů amébózy způsobené Entamoeba histolytica a Entamoeba dispar než metoda čerstvé vizualizace (fyziologický roztok a lugol) u pacientů s akutním průjmovým onemocněním.

Ukázalo se také, že je vysoce citlivý při detekci erythrofagocytózy (améby, které pohlcují erytrocyty).

Barvení histologických řezů pro diagnostiku infekce

Walwyn a kol., V roce 2004 bylo navrženo použití histologických skvrn k detekci mikroorganismů způsobujících infekci.

Pomocí barvení hematoxylin-eosinem byli schopni vizualizovat infekce způsobené Clostridiem, Actinomyces, spirillae nebo Candida. Mohli také pozorovat přítomnost parazita Sarcoptes escabiei v kožních řezech a virové inkluze cytomegalovirem a herpesem v řezech různých tkání.

Techniky

Pro histologické vzorky

Zbarvení histologických řezů prochází řadou kroků. První věcí je získání histologické sekce. To musí být voskované, aby se později řezy (velmi jemné) s mikrotomem získaly. Technika se skládá z následujících kroků:

1-Eliminace přebytečného parafinu: k tomu můžete použít xylol nebo Heme-D, ponořte je na 3-5 minut.

2-Rehydratace vzorku: toho se dosáhne ponořením vzorku do různých koncentrací alkoholů (ethanol) v sestupném pořadí (100 °, 90 °, 70 °). Ve všech případech po dobu 7 minut.

3-Eliminace přebytečného alkoholu: proto je ponořen do vody po dobu 7 minut.

4-Barvení hematoxylinem: vzorek je ponořen po dobu 6-10 minut do podnosu obsahujícího hematoxylin. Doba expozice závisí na velikosti a tloušťce vzorku.

5-Odstranění přebytku hematoxylínu: promývá se vodou po dobu 5 minut a poté se provede kyselý alkohol rychlým průchodem (10-20 sekund). Později se znovu 5 minut promyje vodou. Poté se ponoří do ethanolu při 96 ° po dobu 1 minuty.

6-barvení eosinem: vzorek je proto ponořen po dobu 5 minut do eosinové misky.

7-Dehydratace vzorku: z tohoto důvodu se opět nechá projít zásobníky alkoholu (ethanol), ale tentokrát ve vzestupném pořadí. (70 °, 90 °, 100 °). (Po dobu 5 sekund, 5 sekund, 1 minuta).

8-Vyjasnění vzorku: z tohoto důvodu je vystaven xylolu po dobu 5-10 minut a sušen, aby byl trvale uzavřen s balzamem Kanady nebo jiným podobným materiálem.

Pro vzorky stolice, které hledají

Na sklíčku s pacientovou stolicí se vytvoří skvrna a fixuje se 80% alkoholem po dobu 5 minut. Vrstva se ponoří do hematoxylínu po dobu 5 minut a okamžitě se promyje vodou.

Následně se rychle ponoří do kyselého alkoholu a poté do amoniakové vody. Promývá se vodou. Je zbarvena po dobu 5 minut v eosinu. Vzorek se dehydratuje, jak je vysvětleno v dosavadním stavu techniky, a nakonec se propláchne xylenem.

Příprava činidel

- Hematoxylin

V jednom litru destilované vody rozpusťte 50 gramů síranu hlinitého draselného nebo amonného. Po úplném rozpuštění přidejte 1 gram krystalizovaného hematoxylínu. Po úplném rozpuštění se přidá 1 g kyseliny citronové spolu s 50 g hydrátu chloru a 0,2 g jodičnanu sodného.

Směs se vaří po dobu 5 minut, potom se nechá vychladnout a filtruje se, aby se odstranily všechny pevné částice, které zůstaly. Takto připravené činidlo může být použito okamžitě.

- Eosine

Může být připraven s alkoholovou bází nebo s vodní bází.

Alkoholický eosin

Ve 100 ml ethanolu při 95 ° se rozpustí 0,5 g eosinu "Y". Poté přidejte několik kapek ledové kyseliny octové.

2% vodný eosin

Ve 1250 ml destilované vody se rozpustí 25 gramů eosinu „Y“ rozpustného ve vodě. Poté přidejte několik kapek ledové kyseliny octové.

Kyselý alkohol

Změří se 0,5 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové a doplní se na 100 ml absolutním alkoholem.

Amoniaková voda

Změří se 0,5 ml koncentrovaného amoniaku a doplní se destilovanou vodou na 100 ml.

Reference

1. Navarrete, G. Histologie kůže. Rev Fac Med UNAM 2003; 46 (4): 130-133. K dispozici na adrese: medigraphic.com
2. Gómez-Rivera N, Molina A, García M, Castillo J, Castillo J, García R, Fonseca I, Valenzuela O.
3. Identifikace Entamoeba histolytica / E. Rozptýlení technikou čerstvé améby vs. její barvení hematoxylin-eosinem při akutním průjmu. Rev Mex Pediatr 2005; 72 (3); 109-112. K dispozici na adrese: medigraphic.com
4. Walwyn V, Iglesias M, Almarales M, Acosta N, Mera A, Cabrejas M. Užitečnost histologických technik pro diagnostiku infekce v anatomických vzorcích. Rev Cub Med Mil, 2004; 33 (2). K dispozici na adrese: scielo.sld
5. Reagencie ITR společnosti PanReac AppliChem. Hematoxylin-eosinové barvení. 2017, Španělsko. K dispozici na adrese: itwreagents.com
6. Eosin. Wikipedia, encyklopedie zdarma. 7. listopadu 2018, 08:18 UTC. 4. srpna 2019, 22:13 en.wikipedia.org
7. "Hematoxylin." Wikipedia, encyklopedie zdarma. 3. května 2019, 11:23 UTC. 4. srpna 2019, 22:48 wikipedia.org