KINYOUNOVO BARVENÍ: ZDŮVODNĚNÍ A TECHNIKY - BIOLOGIE - 2025

Barvení Kinyoun je barvení technika používaná pro barvení bakterií a parazitů kyseliny odolnou alkohol. To se zrodilo z modifikace Ziehl-Neelsenova zbarvení; Obě techniky jsou interpretovány stejným způsobem, ale liší se ve dvou prvcích: při přípravě hlavního činidla a v tom, že Kinyounova technika nevyužívá teplo.

Z tohoto důvodu se také nazývá studená skvrna Ziehl-Neelsen nebo studená skvrna Kinyoun. Je indikován pro barvení Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, atypických mykobakterií, Nocardias sp, Cryptosporidium parvum, Cryptosporidium meleagridis, Cryptosporidium felis, Cryptosporidium muris a Cyclosporas cayetanensis.

Cryptosporidium parvum obarvené skvrnou Kinyoun. Punlop Anusonpornperm, od Wikimedia Commons

Za zmínku stojí, že Nocardia se touto technikou slabě zbarví, protože jsou částečně rezistentní vůči kyselinám a alkoholům, takže u tohoto rodu existuje modifikace metodologie.

Naopak studená Kinyounova technika byla kombinována s trichromovou technikou modifikovanou Didierem pro detekci kokcidií (Cryptosporidium parvum a Isospora belli) a spór mikrosporidií (Enterocytozoon bieneusi a Encephalitozoon intestinalis).

Základ

Hlavním barvicím činidlem je karbolfuchsin nebo karbol fuchsin, který má vlastnost vazby na karbolové kyseliny uvnitř voskové buněčné stěny bohaté na lipidy (mykolové kyseliny) mykobakterií a určitých parazitů.

Tato vazba není působena kyselým bělením; proto jsou mikroorganismy definovány jako kyselinově rychlé.

Na rozdíl od Ziehl-Neelsenovy techniky - která fixuje barvivo teplem - není v Kinyounově technice tento krok nutný, protože karbolický fuchsinový roztok připravený pro tuto techniku ​​obsahuje vysokou koncentraci fenolu.

Fenol rozpouští lipidový materiál ve buněčné stěně, což umožňuje vstup karbolfuchsinového barviva. Poté, co barvivo proniká, zůstává pevné i přes kyselý alkohol.

Tímto způsobem kyselinovzdorné mikroorganismy získají charakteristickou červenou barvu, zatímco vše, co není kyselinovzdorné, se zbarví a zbarví se modře.

Technika

materiály

- Modifikovaný karbol fuchsin.

- Alkyselina.

- Methylenová modř.

Příprava fuchsinu karbolu Kinyoun

- Základní fuchsin: 4 gr.

- Fenol: 8 ml.

- Alkohol (95%): 20 ml.

- Destilovaná voda: 100 ml.

Základní fuchsin by se měl pomalu rozpustit v alkoholu za stálého míchání. Následně se krystalizovaný fenol roztaví ve vodní lázni při 56 ° C. Po rozpuštění se k výše připravenému fuchsinovému roztoku přidá 8 ml.

Příprava kyselého alkoholu

- Koncentrovaná kyselina chlorovodíková: 3 ml.

- Ethanol (95%): 97 ml.

Musí být měřeno, spojeno a smícháno.

Příprava kontrastního barviva methylenové modři

- methylenová modrá: 0,3 g.

- Destilovaná voda: 100 ml.

Je zvážena a rozpuštěna.

Technika barvení Kinyoun

1 - Připravte nátěr přímo ze vzorku, kterým může být mimo jiné sputum, plicní tekutina, močový sediment, mozkomíšní mok nebo výkaly; nebo ze suspenze mikroorganismů získaných z čistých kolonií vyvinutých v primárním kultivačním médiu.

2 - Opravte nátěr teplem.

3 - Naneste nátěr na barvicí můstek a přikryjte připraveným fuchsinovým činidlem Kinyoun karbol. Nechte ji odpočívat po dobu 3 až 5 minut.

4. Promyjte destilovanou vodou.

5- Bělte kyselým alkoholem po dobu 3 minut a znovu promyjte destilovanou vodou.

6- Bělte znovu kyselým alkoholem po dobu 1 nebo 2 minut, dokud již nezmizí žádné zbarvení.

7- Opláchněte destilovanou vodou a nechte vypustit, sklíčko umístěte do svislé polohy.

8- Přípravek zakryjte methylenovou modří a nechte působit 4 minuty.

9 - Opláchněte destilovanou vodou a nechte uschnout na vzduchu.

10- Zkontrolujte při 40 x a poté 100 x.

Chcete-li zlepšit a urychlit barvení kyselinovzdorných mikroorganismů, přidejte 1 kapku smáčedla (jako je Tergitol č. 7) do 30 nebo 40 ml Kinyoun Carbol Fuchsin.

Některé laboratoře mění kontrastní barvivo methylenové modři na jasně zelenou nebo pikrovou kyselinu; první dává zelenou barvu pozadí a druhá generuje žlutou barvu.

Speciální technika Kinyoun pro Nocardias

Ke zlepšení barvení bakterií rodu Nocardia se používá modifikace Kinyounova barvení. Technika je následující:

1 - Roztěr zakryjte fuchsinem Kinyoun z karbolu po dobu 3 minut.

2. Promyjte destilovanou vodou.

3 - Krátce zabarvte kyselým alkoholem připraveným ve 3%, dokud již nezmizí žádné zbarvení.

4. Promyjte znovu destilovanou vodou.

5- Přípravek zakryjte methylenovou modří a nechte působit 30 sekund.

6 - Omyjte destilovanou vodou a nechte uschnout na vzduchu.

Kombinovaná karbol fuchsinová a trichromová technika modifikovaná Didierem

Tato technika se doporučuje pro analýzu vzorků stolice na spory kokcidií a Microsporidium sp. Postup je následující:

1 - Roztěr zakryjte fuchsinem Kinyoun z karbolu po dobu 10 minut.

2 - Odstraňte barvivo a omyjte destilovanou vodou.

3. Bělte po dobu 30 sekund alkoholem kyseliny chlorovodíkové.

4. Promyjte znovu destilovanou vodou.

5- Nátěr zakryjte roztokem trichromu po dobu 30 minut při 37 ° C.

6 - Omyjte destilovanou vodou.

7- Bělte po dobu 10 sekund alkoholem kyseliny octové.

8- Omyjte nátěr po dobu 30 sekund pomocí 95% ethanolu.

QA

Jako pozitivní kontrola jsou připraveny nátěry kmenů Mycobacterium tuberculosis a obarveny reagenciemi připravenými k ověření, že bakterie nabírají vhodnou barvu (červená fuchsie).

Negativní kontroly lze také použít přípravou nátěrů s jakýmkoli jiným kmenem než kyselým alkoholem rychle, čímž se ověřuje, že celý vzorek nabírá kontrastní barvu.

Kinyounova technika ve srovnání s technikou Ziehl-Neelsen

Technika Kinyoun je jednodušší, protože eliminuje krok zahřívání, ale jeho hlavní výhodou je, že se dlouhodobě vyhýbá emisím par, vysoce toxických a způsobujících rakovinu. Proto je skvrna Kinyoun bezpečnější pro barvící personál.

Je důležité vzít v úvahu, že je třeba dbát na to, aby činidla nepřicházela do přímého styku s kůží, protože jsou žíravá a bělidlo je hořlavé.

Pokud jde o nevýhody, negativní nátěr nemusí nutně znamenat, že organismus není přítomen. Kromě toho přítomnost buněčných zbytků může vést k falešně pozitivním výsledkům, což vede k záměně v diagnostice.

Odkaz

1. Aplikovaná klinická chemie. (2016). BK Kinyoun Kit.K dispozici na: cromakit.es
2. Orozco-Rico Miguel. Kinyoun skvrna a dvě Coccidia u HIV. Medical Journal MD. 2011; 3 (2): 137
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Bailey a Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Argentina. Editorial Panamericana SA
4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. (5. vydání). Argentina, Editorial Panamericana SA
5. Přispěvatelé Wikipedie. "Kinyounská skvrna." Wikipedia, encyklopedie zdarma. Wikipedia, The Encyclopedia, 8. února 2018. Web. 5. ledna 2019.
6. Combol A, Fernández N, Figueredo E, Acuña A, Zanetta E. Implementace barvicí techniky pro současnou diagnostiku Coccidia a Microsporidia. Hygienický ústav University of Republic. Montevideo. Uruguay. K dispozici na adrese: hygiene.edu.uy