NEGATIVNÍ BARVENÍ: ZDŮVODNĚNÍ, TECHNIKA, VÝHODY A NEVÝHODY - BIOLOGIE - 2025

Negativní barvení je metoda speciální zbarvení upozornit na přítomnost kapsle v některých mikroorganismů, zejména Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae a Cryptococcus neoformans-, z klinických vzorků nebo čistých kultur.

Přímým vzorkem běžně používaným k aplikaci negativního barvení je mozkomíšní mok. Tato technika představuje rychlou alternativu k předpokládané diagnóze meningitidy, zejména Cryptococcus neoformans.

A. Zubní tatarák barvený indickou barvou, B. Cryptococcus neoformans var gatti slabě opouzdřený, jak se vyskytuje v přírodě, za použití nigrosinu. C. Cryptococcus neoformans var gatti s hustou tobolkou, která se nachází v její parazitické formě, za použití nigrosinu. D. Cryptococcus neoformans s mírně naředěnou indickou barvou. Gisell Quinde, od Wikimedia Commons / CDC, přes Wikimedia Commons / Photo Credit: Poskytovatelé obsahu: CDC / Dr. Leanor Haley, prostřednictvím Wikimedia Commons

Stejně tak může být toto barvivo aplikováno na sputum a sterilní tekutiny obecně, jakož i na kmeny získané z mladých čistých kultur. Tato technika používá nigrosine nebo indický inkoust pro jeho provedení; proto je to velmi jednoduchá a levná metodologie, která poskytuje informace s velkou diagnostickou hodnotou v krátkém čase.

V tomto smyslu je jakákoli laboratoř schopna provést toto barvení. Laboratoř musí samozřejmě mít kvalifikovaný personál, který je schopen rozeznat izolované nebo pučící kvasinky Cryptococcus neoformans a odlišit je od leukocytů a artefaktů, které může vzorek obsahovat.

Základ

Inkoust Nigrosine a Indie pracuje podobně; proto lze kteroukoli z těchto dvou látek použít zaměnitelně.

Tato technika se nazývá negativní barvení, protože působí opačně než zbytek technik barvení. V tomto zůstává nezjištěná struktura, která je hledána nebo kterou si člověk přeje vidět; to znamená, mikroorganismy.

Proto je barvení založeno na barvení spodní části nátěru tmavou barvou. V tomto scénáři budou kapsulované struktury vyniknout světlou nebo bezbarvou barvou.

Obecně jsou kvasinky refringentní, obklopené čirým halo, které odpovídá tobolce. K tomu dochází, protože indický inkoust a nigrosin jsou látky neschopné proniknout polysacharidem, který tvoří kapsli živých mikroorganismů.

Je třeba poznamenat, že jiné struktury, které mohou být přítomny v přímém vzorku, jako jsou leukocyty nebo červené krvinky, nepronikají.

Nyní, pokud jsou mikroorganismy mrtvé, může barvivo proniknout dovnitř, takže toto barvení je také užitečné pro vyhodnocení životaschopnosti mikroorganismů.

Technika

materiály

Nigrosin

Nigrosine vděčí za svůj název černé barvě, kterou má. Je to syntetická látka, která se získává zahříváním směsi organických sloučenin - jako je nitrobenzin, anilin a anilin-hydrochlorit - za použití katalyzátoru (železo nebo měď) v uvedené reakci.

Čínský inkoust

Čínský inkoust je látka používaná hlavně Asijci pro psaní, výrobu uměleckých děl a monochromatický obraz. V čínské kultuře je velmi populární.

Získává se z olihně tiskařské barvy smíchaného s práškovým uhlím, což je produkt spalování nízko-pryskyřičných stromů.

Je také možné ho připravit ze sazí ze spalování uhlovodíků (rostlinných olejů), spolu s proteinovou želatinou, která mu dává správnou konzistenci, aby se zabránilo vysrážení uhlíkových částic.

Specifikace pro odběr vzorků

- Nevyžaduje půst.

- Vzorek CSF, sputa nebo sterilní tekutiny musí obsahovat nejméně 1 ml objemu a musí být okamžitě přenesen do laboratoře při pokojové teplotě.

- Vzorky CSF a sterilní tekutiny musí odebírat specializovaný lékař.

- Může to být také čistá kultura podezřelého kmene spojeného s výše uvedenými patogeny.

Provedení techniky s přímými vzorky

- Vzorky se musí odstředit, poté se supernatant odstraní a odebere se sediment.

- Kapka centrifugovaného materiálu (sediment) a kapka indického inkoustu nebo nigrosinu se umístí na čisté sklíčko.

- Měl by být dobře promíchán a zakryt krycí fólií, aby se kapka mohla šířit jako tenký film, aniž by přesahovala okraje.

- Následně se přípravek nasadí na mikroskop.

- Pokud je přípravek příliš tmavý, lze jej naředit vodou.

Provedení techniky kmeny z kultury

- Velmi malá část mladé kultury se odebere očkovací jehlou a rozpustí se v kapce indického inkoustu předtím umístěného na čisté sklíčko.

- Krycí sklíčko je umístěno nahoře.

- Je pozorováno v mikroskopu 10x a poté 40X.

Část kolonie můžete také rozpustit v destilované vodě a odtud kapku smíchat s indickým inkoustem. Tímto způsobem nebude přípravek tak silný, což umožní pozorovat struktury izolovaně; pokud existují davy, nebude to dobře dodržováno.

Další metodologie je následující:

- Umístěte kapku suspenzní kultury na jeden konec sklíčka.

- Umístěte kapku nigrosinu na stejný konec a promíchejte.

- Pomocí dalšího sklíčka rozprostřete vzorek, jako by vytvořil hematologický nátěr.

- Nechte zaschnout a pozorujte pod mikroskopem.

Pozorování mikroskopem

Nejprve musíte zaostřit objektivem 10X, abyste měli široký výhled na pole. Následně by se mělo hledat, zda existují volné prostory; pokud ano, zaostřete 40x a uvidíte podrobnosti.

Výhoda

- Je snadné provést.

- Je to levná technika.

- Tato metoda nevyžaduje, aby nátěr byl připevněn k teplu nebo chemikáliemi; proto jsou mikroorganismy pozorovány bez zkreslení.

- Čerstvý přípravek nemusí být sušen, takže jej lze okamžitě pozorovat a rychle dosáhnout výsledků.

Nevýhoda

Po sestavení musí být čerstvé přípravky okamžitě pozorovány; pokud se nechá uschnout, není již možné je pozorovat a musí být nainstalován nový.

Tkáňové barvení indickým inkoustem

Další funkcí, kterou může inkoust Indie splnit, je v patologických laboratořích. To se aplikuje na chirurgicky extrahované vzorky tkáně, aby se vyznačily resekční okraje nádoru.

Značená tkáň se postříká kyselinou octovou. To působí jako mořidlo a zabraňuje úniku inkoustu, když je tkáň podrobena rutinnímu zpracování pro přípravu biopsie.

Procedura spočívá v koupeli tkáně v alkoholu a xylenu a poté namočení do parafínového vosku. Toto označení vede patologa při pozorování tkáně a ukazuje, kde je chirurgická resekční rozpětí nebo jiné zajímavé místo.

Reference

1. «Nigrosina». Wikipedia, encyklopedie zdarma. 11. července 2017, 22:46 UTC. 6. ledna 2019, 16:56: en.wikipedia.org
2. "Čínský inkoust". Wikipedia, encyklopedie zdarma. 1. října 2018, 03:08 UTC. 6. ledna 2019, 18:20: es.wikipedia.org/
3. Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macías J a spolupracovníci. (2006). Pracovní personál autonomního společenství Extremadura. Specifická agenda Svazek IV. Redakční MAD. Seville-Španělsko, str. 211-212.
4. Silva M., García M., Corrales J., Ponce E. (2006). Odborný laboratorní technik, Galician Health Service (SERGAS). Specifický předmět agendy 2. Redakční MAD. Seville-Španělsko, str. 79-80.
5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Argentina. Editorial Panamericana SA