OXIDÁZOVÝ TEST: ZDŮVODNĚNÍ, POSTUP A POUŽITÍ - BIOLOGIE - 2025

Test oxidáza je diagnostická metoda, která ukazuje přítomnost enzymu komplexu s názvem cytochrom oxidázy c. Tento systém indukuje přeměnu redukovaného cytochromu na oxidovanou, protože zachycuje kyslík a to zase působí jako poslední elektronový akceptor (H ⁺) v respiračním řetězci.

Termín oxidáza je krátký způsob, jak se odkazovat na enzym cytochrom oxidáza, také známý jako indophenol oxidáza. Ve starověku se věřilo, že enzymy cytochrom oxidáza a indofenol oxidáza jsou dva různé enzymy, ale dnes je známo, že jsou stejné.

Pozitivní a negativní oxidáza. Zdroj: Nebyl poskytnut žádný strojově čitelný autor. Alpha.prim ~ commonswiki převzato (na základě nároků na autorská práva).

Cytochromy jsou hemoproteiny, které obsahují železo a doplňují systém cytochrom oxidázy. Cytochromy se mohou lišit od druhu k druhu.

Existují různé druhy cytochromů (cytochromy a1, a2, a3 a 0). Některé bakterie mohou produkovat pouze jednu, ale jiné až dvě nebo tři najednou. V tomto smyslu je přítomnost cytochromu a a a3 známá jako cytochrom oxidáza c. Toto je typ cytochromu, který detekuje test oxidázy.

Rod Neisseria a Pseudomonas obsahují cytochrom oxidáza c. Tato rody dávají pozitivní oxidázový test, což pomáhá odlišit je od rodů Acinetobacter a Stenotrophomonas.

Existují také další rody, které jsou pozitivní na oxidázu.

Základ

Charakteristika systému cytochrom oxidázy c

Systém cytochrom oxidázy c funguje následujícím způsobem: mikroorganismy pozitivní na oxidázu používají kyslík k vytváření energie prostřednictvím aerobního dýchání. Tento systém funguje díky transportu elektronů z donorových látek, jako je NADH ^+, do receptorových látek, v tomto případě kyslíku.

To má za následek produkci energie (ATP) a vody nebo peroxidu vodíku v závislosti na systému cytochrom oxidázy, který mikroorganismus vlastní.

Proto je většina bakterií pozitivních na oxidázu pozitivní také na katalázu, což je nezbytná podmínka pro odstranění produkovaného peroxidu vodíku, protože tato látka je pro bakterie toxická.

Systém cytochrom oxidázy c je přítomen v některých aerobních bakteriích, některých fakultativních anaerobech, několika mikroaerofilních a žádných přísných anaerobech. Ten je pochopitelný, protože přísné anaeroby nemohou žít v přítomnosti kyslíku, a proto jim chybí systém cytochrom oxidázy.

Princip zkoušky

V tomto testu používá látky, které fungují jako umělé akceptory elektronů a nahrazují přirozené v řetězci přenosu elektronů.

Používají se hlavně barviva jako parafenylenediamin a indofenol, která působí jako substráty receptorů a umělé donory elektronů.

Parafenylenediamin je oxidován systémem cytochrom oxidázy c. Barvivo v redukované formě je bezbarvé, ale ve své oxidované formě je zbarveno.

Takto je prokázána přítomnost systému cytochrom oxidázy c; protože pozitivní reakce vytvoří levandulovou nebo modro-fialovou barvu v závislosti na použitém činidle.

Na druhé straně, pokud se poslední látka přijímající elektron v dýchacím řetězci liší od kyslíku, bude oxidázový test negativní (nedochází k tvorbě barev); to je případ anaerobních mikroorganismů.

Podobně, pokud se cytochrom používaný mikroorganismem liší od cytochrom oxidázy c, dá se také negativní test.

Proces

Pro oxidázový test existují různá činidla a protokoly, to vše pro stejný účel.

Činidla

Kovacsovo činidlo, Gordonovo a McLeodovo činidlo, Nadiovo činidlo, Carpenterovo, Suhrlandovo a Morrisonovo činidlo a použití oxidázových disků.

-Kovacs oxidázové činidlo

Je tvořen 1% tetramethyl-p-fenylenediamin-dihydrochloridem.

Kovacsovo činidlo se připravuje rozpuštěním 1 g výše uvedené látky v 50 ml destilované vody. Mírně se zahřívá, dokud se úplně nerozpustí. Přeneste do jantarové láhve dostatečné kapacity a doplňte objem na 100 ml destilovanou vodou. Před použitím počkejte alespoň 15 minut. Uchovávejte v chladničce chráněné před světlem.

Je označen jako Kovacs oxidázové činidlo, aby se odlišil od Kovacsovho činidla použitého k odhalení indolového testu. Toto činidlo je nejcitlivější, méně toxické, ale je dražší než ostatní činidla.

Pozitivní reakce se projeví u tohoto činidla se změnou barvy kolonie na levandule, která rychle zbarví na téměř černou. Negativní reakce je zřejmá, protože nedochází k žádné změně barvy v kolonii nebo má mírně narůžovělou barvu. Médium může také ztmavnout, ale to neznamená pozitivní reakci.

U tohoto činidla je reakční doba rozhodující, změna barvy, která nastane mezi 5 až 15 sekundami, se považuje za pozitivní reakci.

-Gordon a McLeodovo činidlo

Je tvořen dihydrochloridem dimethyl-p-fenylenediaminu, známým také jako N-dimethyl-p-fenylenediamin nebo monohydrochlorid p-aminodimethylanilinu. Je připravena tak, jak je popsáno pro Kovacs oxidázové činidlo, nahrazující příslušnou látku.

Toto činidlo je o něco stabilnější než Kovacs oxidázové činidlo, ačkoli všechna činidla obsahující p-fenylenediamin jsou nestabilní.

Tato reakce je později, je interpretována jako pozitivní s výskytem modro-fialové barvy během 10 až 30 minut.

-Nadi činidlo

Skládá se z 1% a-naftolu v ethylalkoholu (95% ethanol) a 1% aminodimethylanilinu. Směs se připravuje ve stejných částech a za použití absolutního ethylalkoholu jako ředidla, dokud se nedosáhne dostatečného množství na 100 ml.

-Parpenter, Suhrland a Morrisonovo činidlo

Skládá se z 1% oxalátu p-aminodimethylalaninu. Připraví se stejným způsobem, jaký je popsán pro Kovacs oxidázové činidlo, přičemž se mění odpovídající látka.

S připraveným roztokem se připravují testovací proužky následujícím způsobem: 6-8 cm proužky filtračního papíru Whatman No. 1 jsou impregnovány 1% dimethyl-p-fenylendiamin oxalátovým činidlem.

Nechají se vyschnout bez kontaktu s kovem, skladují se ve skleněných nádobách se sušidlem a skladují se v lednici. Tyto proužky jsou stabilní až 6 měsíců.

Je to nejstabilnější činidlo ze všech uvedených látek a může v roztoku vydržet až 6 měsíců. Dalším plusovým bodem je, že nezbarví médium kolem kolonie, pokud se použije přímo na desce.

Vzhled červené barvy je interpretován jako pozitivní test.

-Oxidázové disky

Jsou to komerční disky, které jsou impregnovány činidlem pro test oxidázy. Na trhu existuje několik komerčních značek.

Jeho použití je docela praktické, protože není nutné připravovat čerstvá činidla, což usnadňuje práci. Získané výsledky jsou spolehlivé, pokud jsou disky správně uchovány.

Protokoly

Metoda přímé destičky, nepřímá metoda na papíře a použití disků impregnovaných oxidázovými činidly.

- Metoda přímé desky

2 nebo 3 kapky jakéhokoli z výše uvedených činidel se k tomuto účelu přidají přímo na kolonii (y) obsažené v destičce kultivačního média, která neobsahuje glukózu.

Interpretace nebo změna barvy kolonií není interpretována, nikoliv média. Platná reakční doba závisí na použitém činidle.

- nepřímá metoda na papíře

Nařežte kousek filtračního papíru (Whatman č. 1) na velikost 6 cm ² a vložte jej do prázdné Petriho misky.

Do papíru přidejte 2 nebo 3 kapky činidla Kovacs oxidázy, zúčastněte se kolonie, která se má studovat, pomocí platinové rukojeti nebo dřevěného párátka a rozložte ji v přímce na papír impregnovaný činidlem. Interpretujte do 5 až 10 sekund.

S proužky připravenými pomocí činidla Carpenter, Suhrland a Morrison se na suchý proužek nanese kolonie. K testování několika kmenů se používá jeden proužek. Interpretovat za 10 sekund.

-Disks (m

Komerční disky jemně navlhčete sterilní destilovanou vodou a položte na studovanou kolonii. Doporučuje se používat destičky při 35 ° C, pokud se používají destičky při pokojové teplotě nebo chlazené destičky, reakce je o něco pomalejší. Interpretujte změnu barvy mezi 10 a 20 sekundami.

Lze použít kolonie obsažené na krevním nebo čokoládovém agaru.

-Disks (nepřímá metoda)

Navlhčete disk, jak bylo popsáno výše. Umístěte jej do prázdné Petriho misky. Vezměte dostatečné množství kolonie ke studiu s platinovou rukojetí nebo dřevěným párátkem a umístěte na disk. Interpretujte změnu barvy mezi 10 a 20 sekundami.

Použití

Rod Neisseria a Acinetobacter jsou někdy morfologicky velmi podobné, protože ačkoli je rod Acinetobacter gram-negativní tyčinkou, může mít někdy formu kokosu a může být distribuován ve dvojicích, což simuluje rod Neisseria.

V tomto případě je oxidázový test opravdu užitečný. Rod Neisseria je pozitivní a Acinetobacter negativní.

Rod Moraxella je však velmi podobný rodu Neisseria a oba dávají pozitivní reakci; Z tohoto důvodu musí být pro definitivní identifikaci vždy provedeny fermentační zkoušky na uhlohydrátech.

Na druhé straně je oxidázový test užitečný k odlišení bakterie patřící do rodiny Enterobacteriaceae (všechny oxidáza negativní) od jiných fermentorů, jako je rod Pasteurella, Aeromonas, Plesiomonas (oxidáza pozitivní).

Rod Vibrio a Helicobacter jsou také oxidázově pozitivní.

QA

Jako negativní kontrolu použijte známé kmeny Escherichia coli a jako pozitivní kontrolu kmeny Pseudomonas aeruginosa.

Omezení

- Činidla musí být použita čerstvě připravená, jejich skladovatelnost v roztoku při pokojové teplotě je krátká, protože jsou velmi nestabilní. Chlazené mohou trvat 5 až 2 týdny.

- Činidla jsou bezbarvá, pokud změní barvu, musí být zlikvidována. Poškozené disky se objeví, protože postupem času ztmavnou.

- Pozitivní reakce s Kovacs oxidázovým činidlem mezi 15-60 s je považována za opožděnou reakci a po 60 sekundách by měla být považována za negativní.

-Hememhylhyl influenzae dává negativní oxidázovou reakci, pokud se použije jakékoli činidlo s dimethyl-p-fenylenediaminem, ale pozitivní, pokud se použije Kovacsovo oxidázové činidlo (tetramethyl-p-fenylenediamin).

-Medium obsahující glukózu interferuje s testem, což vede k falešným negativům.

- Kmeny Boretella pertussis mohou vyvolat falešně pozitivní reakci, pokud pocházejí z vysoce koncentrovaných destiček na krevním agaru.

- Použití kovových (železných) úchytů dává falešně pozitivní reakci.

doporučení

- Protože jsou činidla velmi nestabilní a mají tendenci se samoxidovat, doporučuje se zmrazit alikvoty o objemu 1 až 2 ml a podle potřeby je odstranit.

- Dalším zpožděním pro autooxidaci činidla je přidání 0,1% kyseliny askorbové při přípravě reagencií.

- Protože jsou činidla nestabilní, doporučuje se kontrola kvality každý týden.

- Neměli by se používat reagenti, kteří neprošli zkouškou kontroly kvality.

Reference

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey a Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
3. "Oxidázový test." Wikipedia, encyklopedie zdarma. 15. ledna 2018, 10:32 UTC. 3. dubna 2019, 14:03
4. Světová zdravotnická organizace. Laboratorní příručka pro identifikaci a testování citlivosti bakteriálních patogenů na veřejné zdraví v rozvojových zemích na antimikrobiální látky. K dispozici na adrese: who.int/drugresistance/infosharing
5. Reagenční proužky pro diagnostiku oxidázové aktivity u bakterií. Rev Cubana Med Trop. 2000; 52 (2): 150-151.