XANTHOMONAS CAMPESTRIS: POPIS, KULTIVACE A PATOLOGIE - BIOLOGIE - 2025

Xanthomonas campestris je druh proteobakterií (třída: Gama Proteobacteria, řád: Xantomonadales, rodina: Xanthomonadaceae) fytopatogenní, který ovlivňuje důležité plodiny.

X. campestris představuje epifytickou fázi na rostlině, ve které ji nepoškozuje. Tato fáze je před infekcí, je generována, když bakterie proliferují díky příznivým změnám prostředí. Infekce tímto druhem způsobuje v napadené rostlině řadu příznaků, které se mohou nakonec zvrhnout do smrti.

Obrázek 1. Příznaky způsobené infekcí X. campestris. Zdroj: autor Ninjatacoshell, Wikimedia Commons.

X. campestris je také dobře známý pro výrobu biopolymeru xanthanové gumy nebo xanthanu, polysacharidu, který se vylučuje do média (exopolysacharid) a zvyšuje viskozitu vodných roztoků.

Exopolysacharid xanthan byl první komerčně důležitý vedlejší produkt generovaný fermentačními procesy kukuřičných škrobů. V současné době se vyrábí ve velkém množství a díky svým vlastnostem jako zahušťovadlo a emulgátor má mnoho aplikací. Xantan se používá mimo jiné v potravinářském, farmaceutickém, kosmetickém, zemědělském a ropném průmyslu.

Popis

Xanthomonas campestris je gram-negativní, povinný aerobní fakultativní saprofytní bacil. Je mobilní, široký mezi 0,2 a 0,6 um a mezi 0,8 a 2,9 um dlouhými. Může se objevit jako osamělý jednotlivec nebo formující vlákna obklopená xantanem, exopolysacharidem, který produkují.

Xanthan zvýhodňuje tvorbu biofilmů X. campestris a také vykonává ochranný účinek na společenství založená v této struktuře, když dojde k náhlým změnám teploty, pH, ultrafialového záření, výrazných osmotických změn a / nebo snížení vlhkosti.

Interakce s rostlinou

Tento druh má několik mechanismů, jak se vyhnout obranným reakcím rostlin, které infikuje. První bariérou rostliny proti bakteriální infekci jsou buněčné stěny a povrchové látky s antimikrobiální aktivitou.

X. campestris může infikovat rostlinu prostřednictvím listové stomaty (póry, kde dochází k výměně plynu s prostředím), jejích hydatodů (typ stomie, kde se vylučuje přebytečná voda), nebo prostřednictvím existujících ran.

Rostliny obecně uzavírají své stomaty, když jsou napadeny mikroorganismy. X. campestris však produkuje virulenční faktor, který brání uzavírání stomat, čímž se zvýhodňuje vstup dalších bakterií do rostliny z vnějšího prostředí.

Když jsou bakterie uvnitř rostliny, brání transportu vody tím, že brání cévním tkáním. Výsledkem je nekróza listů a vadnutí infikovaných částí.

Kromě toho X. campestris produkuje sloučeninu zvanou neutrální cyklický P- (1,2) glukan, který zabraňuje expresi obranných genů v rostlině. Tyto sloučeniny mohou být asociovány s bakteriálním periplazmatickým prostorem nebo mohou být vylučovány do extracelulárního prostředí, což podporuje mobilitu bakterií, jejich virulenci a tvorbu biofilmů.

Xanthan

Xanthan produkovaný Xanthomonasem působí jako virulentní faktor, potlačující imunitní odpověď napadené rostliny a zvyšuje infekční kapacitu bakterií.

Xanthan je polysacharid složený z jednotek 5 cukrů, které se opakují (2 glukosy, 2 manosy a 1 glukuronová kyselina) a polymerizují.

Syntéza xanthanu závisí na operonu zvaném klastrová guma (sada genů, které tvoří funkční jednotku), která má 12 genů, které jsou pod kontrolou jedné promotorové oblasti.

Izolace

X. campestris pv. campestris může být izolován z listové tkáně, která má skvrny ve tvaru "V" nebo z poškozené vaskulární tkáně nebo rostlinného krku, tj. z poškozených oblastí rostliny.

K získání kmenů X. campestris se poraněná oblast vybere jako vzorek (listové nebo ovocné skvrny nebo konzervy). Pokud není v rostlině pozorováno žádné poškození, odebírá se jako vzorek tkáň, která je nejvíce náchylná k poškození, a analyzuje se kultivačním médiem a technikou polymerázové řetězové reakce (PCR).

Kulturní média

Mezi použitá kultivační média patří:

Mléčné doplnění

Pro počáteční izolaci mikroorganismů ze vzorků rostlinné tkáně lze použít mléko Tween (MT):

10 ml odstředěného mléka, 0,25 g CaCI ₂, 10 g peptonu proteázy No. 3, 15 g Bacto agaru, 0,5 g tyrosinu, 10 ml Tween 80, 80 mg cefalexinu (ve 2 ml roztoku hydroxidu sodného na 4%), 200 g cykloheximidu (ve 2 ml 75% methanolu), 100 mg vankomycinu (v 1 ml destilované vody).

Roztoky odstředěného mléka, cefalexinu, cykloheximidu a vankomycinu musí být sterilizovány filtrací a přidány do média při 50 ° C.

King's B

Po umožnění růstu bakteriálních kolonií v MT mohou být ty, které se nejvíce podobají X. campestris (žluté pigmentační kolonie při 72 a 120 hodinách kultivace), přeneseny na Kingovo médium B:

20 g peptonu proteázy č.3, 20 g agar-agar, K ₂ HPO ₄ 1,5 g, MgSO ₄ x / H ₂ O 1,5 g, 10 ml glycerolu, 700 destilované vody.

Médium by mělo být zahříváno za míchání na 80 ° C, doplněno na 1 1 destilovanou vodou a homogenizováno a pH by mělo být upraveno na 7,2. Sterilizuje se při 121 ° C po dobu 15 minut.

Bohaté kultivační médium PYM nebo YMM bylo také použito v kultuře X. campestris.

Obrázek 2. Kultura Xanthomonas v pevném médiu. Zdroj: Jarober3, přes Wikimedia Commons

PYM

K přípravě PYM musíte na každých 1000 ml celkového objemu přidat: 10 g glukózy, 5 g peptonového extraktu, 3 g sladového extraktu a 3 g kvasinek.

Pokud chcete pěstovat v pevném médiu v Petriho miskách, přidejte do směsi také 15 g agaru.

Ymm

Pro přípravu YMM médium, je třeba na každých 1000 ml celkový objem: 10 g glukózy, 1 ml MgSO ₄: 7H ₂ O roztoku (10 g / l), 1 ml CaCI ₂ roztoku (22 g / l), 1 ml k ₂ HPO ₄ roztoku (22 g / l), 1 ml FeCl ₃ roztoku v 0,1 m HCI (2 g / l), 0,3% m / v kasaminokyselin (aminokyseliny z hydrolýza kaseinu) a 11% obj. roztoku glutamátu sodného.

Inkubační podmínky

Inkubační podmínky bakteriálních kmenů X. campestris by měly být 27 nebo 28 ° C, a v případě kapalných kultivačních médií by mělo být kontinuální míchání udržováno při 200 otáčkách za minutu (ot / min).

Xantanová produkce

Pokud je požadována výroba xanthanu ve fermentačním procesu, musí být jako zdroj uhlíku dodána glukóza, sacharóza nebo kukuřičný sirup (mezi 20 a 40 g / l), mezi jinými živinami, které poskytují dusík.

Detekce metabolické aktivity

Pro detekci přítomnosti životaschopného X. campestris v rostlinné tkáni někteří vědci doporučují spíše měřit metabolickou aktivitu než mikrobiální růst v laboratorní kultuře.

Měření metabolické aktivity bylo provedeno pomocí indikátoru životaschopnosti prostřednictvím systému přenosu elektronů. Tato sloučenina se nazývá tetrazolium a její soli přijímají elektrony z vodíku a vytvářejí formazan, látku nerozpustnou ve vodě. Vzhled uprostřed formazanu je tedy indikátorem buněčné metabolické aktivity.

Jedno z kultivačních médií X. campestris, které provádí tento test životaschopnosti, obsahuje tetrazoliumchlorid (TTC), trifenyltetrazoliumchlorid a další přísady, jako je chlorid sodný a cukry. Jde o médium s následujícími látkami pro celkový objem 500 ml: 5 g peptonu, 0,5 g hydrolyzovaného kaseinu, 2,5 g glukózy a 8,5 g agaru.

Patofyziologie

Bakterie X. campestris je původcem četných chorob, které ovlivňují listy okrasných rostlin (jako je Anthurium andreanum) a fazole obecné (Phaseolus vulgaris L.). Ovlivňují také plody kamene, jako jsou mandle, nektarinky, třešně, broskve, meruňky, švestky.

Je známo, že X. campestris ovlivňuje rod Brassicaceae nebo kruciferous, protože patří mezi 10 fytopatogenních druhů nejnebezpečnějších pro zemědělskou činnost, zejména v tropech.

Například X. campestris způsobuje černé hniloby u květáku (Brassica oleracea), brokolice (B. napus), čínského zelí (B. pekinensis), tuřín (B. rapa), hořčice (B nigra), ředkvičky (Rhaphanus sativus) a zelí (B. fruticulosa).

Obrázek 3. List zasažený X. campestris. Zdroj: David B. Langston, prostřednictvím Wikimedia Commons

Příznaky vyvolané X. campestris se objevují zpočátku na listech a poté se mohou objevit na ovocích a větvích. Zahrnují nepravidelné a úhlové nažloutlé skvrny listů (1 až 5 mm v průměru) omezené žilami, které jsou nakonec nekrotizovány.

Popálení listů také dochází; skvrny na ovocích; vaskulární vadnutí a výskyt chlorotických nebo nekrotických lézí ve tvaru písmene „V“.

Skvrny se objevují na okrajích listů a obklopují jeho střední vrstvu. Na rostlině může dojít ke ztrátě listů. Zelené skvrny se objevují na plodech, které se stávají nekrotickými, a mohou je také popraskat. Může dojít také k tankerům.

Reference

1. Dow, JM, Crossman, L., Findlay, K., He, Y.-Q., Feng, J.-X., & Tang, J.-L. (2003). Disperze biofilmu v Xanthomonas campestris je řízena signalizací buněčných buněk a je vyžadována pro plnou virulenci rostlin. Sborník Národní akademie věd, 100 (19), 10995–11000. doi: 10,1073 / pnas.1833360100
2. Hayward, AC, Swings, JG a Civerolo, EL (1993). Xanthomonas. Springer Nizozemsko. str. 407.
3. Papagianni, M., Psomas, S., Batsilas, L., Paras, S., Kyriakidis, D. a Liakopoulou-Kyriakides, M. (2001). Produkce Xanthanu Xanthomonas campestris v dávkových kulturách. Process Biochemistry, 37 (1), 73-80. doi: 10,016 / s0032-9592 (01) 00174-1
4. Rosalam, S., & England, R. (2006). Přehled produkce xanthanové gumy z nemodifikovaných škrobů enzymem Xanthomonas campestris Enzyme and Microbial Technology, 39 (2), 197–207. doi: 10,016 / j.enzmictec.2005.10.019
5. Stewart, P. a Globig, S. (2011). Fytopatologie v rostlinách. Apple Academic Press. str. 334.