REKOMBINANTNÍ DNA: TECHNIKA, APLIKACE A ZÁKLADY - BIOLOGIE - 2025

Rekombinantní DNA (rDNA nebo rDNA) je umělá molekula nukleové kyseliny vytvořené v laboratoři, prostřednictvím integrace dvou segmentů zájmových organizací. Je známá také jako chimérická DNA díky své hybridní vlastnosti. Tento typ DNA se v přírodě nenachází.

Základní metodika pro jeho generování zahrnuje: (a) výběr cílové DNA a její inzerci do jiného fragmentu DNA (obvykle bakteriálního plazmidu); (b) zavedení tohoto plazmidu do bakterie, (c) selekce bakterií pomocí antibiotik a nakonec (d) exprese genu.

Zdroj: pixabay.com

Tato technika využívá řadu enzymů, které umožňují kopírovat a vložit specifické fragmenty DNA podle úsudku výzkumného pracovníka.

Cílem rekombinantní technologie je ve většině případů exprese proteinu (známého jako rekombinantní protein), který molekulární biolog potřebuje pro budoucí výzkum nebo k vytvoření proteinu komerční a terapeutické hodnoty - jako je lidský inzulín, například.

Základy techniky rekombinantní DNA a její využití v genetickém inženýrství

Centrální dogma molekulární biologie

Všechny organické bytosti, které známe, mají několik vlastností. Jednou z nich je povaha genetického materiálu a způsob výroby proteinů - proces známý jako centrální „dogma“ molekulární biologie.

S výjimkou několika virů ukládají všechny organismy genetické informace v DNA (kyselina deoxyribonukleová), které se shromažďují velmi kompaktním a uspořádaným způsobem v jádru buňky.

Pro genovou expresi je molekula DNA přepsána do messengerové RNA a ta je přeložena do jazyka aminokyselin, stavebních bloků proteinů.

Co je to rekombinantní DNA?

Mezi 70. a 80. roky začali molekulární biologové využívat procesy, které se přirozeně vyskytují uvnitř buňky, a byli schopni je extrapolovat do laboratoře.

Tímto způsobem by mohl být gen živočišného původu (například obratlovců) vložen do segmentu DNA z bakterie; nebo DNA bakterie může být kombinována s virovou DNA. Můžeme tedy definovat rekombinantní DNA jako molekulu tvořenou DNA ze dvou různých organismů.

Po vytvoření této hybridní nebo rekombinantní molekuly je exprimován požadovaný gen. Výrazem slovo chceme odkazovat na proces translace na protein.

Restrikční enzymy a ligázy: klíč k procesu

Klíčovým prvkem ve vývoji technologie rekombinantní DNA byl objev restrikčních enzymů.

Jedná se o proteinové molekuly, které vykazují schopnost štěpit DNA (nukleázy) na specifické sekvence, které slouží jako „molekulární nůžky“. Fragmenty generované těmito enzymy se nazývají restrikční fragmenty.

Uvedené enzymy mohou produkovat symetrické řezy v cílové sekvenci (v obou řetězcích ve stejné výšce) nebo asymetrické řezy. Klíčovým aspektem působení restrikčních enzymů je to, že po štěpení řetězců je získána "volná hrana", která je komplementární k druhé hraně řezané stejným enzymem.

Některé příklady jsou ECOR 1 a Sma 1. V současné době je známo a komerčně dostupných více než 200 typů restrikčních enzymů.

Aby byly užitečné, musí být nůžky doprovázeny lepidlem. Toto těsnící působení DNA (dříve ošetřené restrikčními enzymy) se provádí ligázami.

Technika: jak je DNA organismu uměle změněna v laboratoři?

Níže popíšeme hlavní kroky, které vyžaduje technologie rekombinantní DNA. Všechny jsou prováděny odborníky v laboratoři molekulární biologie.

Co je to „klon“?

Než budeme pokračovat v experimentálním protokolu, musíme si uvědomit, že v molekulární biologii a biotechnologii se často používají výraz „klon“ a sloveso „klon“. To by mohlo vést k nejasnostem.

V této souvislosti nehovoříme o klonování celého organismu (například v případě slavné ovce Dolly), ale o klonování části DNA, která může být genem. To znamená, že se vytvoří mnoho kopií - geneticky identických - sekvence.

1. Izolace a získání DNA

Prvním krokem je rozhodnutí, kterou sekvenci chcete použít. To zcela záleží na výzkumníkovi a cílech jeho práce. Tato DNA musí být izolována a vyčištěna. Metody a postupy, jak toho dosáhnout, závisí zase na těle a tkáni.

Obecně je část tkáně odebrána a podrobena ošetření v lytickém pufru s proteinázou K (proteolytický enzym) a poté je DNA extrahována. Následně je genetický materiál fragmentován na malé fragmenty.

2. Klonovací vektor

Po přípravných krocích se vědec snaží zavést požadovaný segment DNA do klonovacího vektoru. Od této chvíle budeme tento segment DNA bílé DNA nazývat.

Plazmidy

Jeden z nejpoužívanějších vektorů v plazmidu bakteriálního původu. Plazmid je dvouvláknová molekula cirkulární DNA, která se přirozeně vyskytuje v bakteriích. Jsou cizí bakteriálnímu chromozomu - to znamená, že jsou extrachromozomální a vyskytují se přirozeně v těchto prokaryotech.

Základními prvky vektoru jsou: a) počátek replikace, který umožňuje syntézu DNA; b) selekční činidlo, které umožňuje identifikaci organismů, které nesou plazmid s cílovou DNA, jako je rezistence na některá antibiotika; a (c) multiklonovací místo, kde jsou nalezeny sekvence, které budou rozpoznávány restrikčními enzymy.

První úspěšná rekombinantní DNA v laboratoři byla klonována do plazmidu pSC101 z bakterie E. coli. Toto obsahuje restrikční místo pro restrikční enzym EcoRI a gen pro odolnost vůči antibiotikům, kromě počátku replikace.

Vkládání cílové DNA do plazmidu se provádí za použití molekulárních nástrojů restrikčních enzymů a ligáz popsaných v předchozí části.

Zbývající typy vektorů

Kromě plazmidů může být DNA vložena do jiného vektoru, jako je bakteriofág lambda, kosmidy, YAC (kvasinkové umělé chromozomy), BAC (bakteriální umělé chromozomy) a fagemidy.

3. Zavedení rekombinantní DNA

Jakmile je získána rekombinantní molekula DNA (gen zájmu v plazmidu nebo jiném vektoru), je zavedena do hostitelského nebo hostitelského organismu, kterým může být bakterie.

K zavedení cizí DNA do bakterie se používá technika zvaná bakteriální transformace, při které je organismus podroben ošetření dvojmocnými kationty, díky nimž je náchylný k absorpci DNA.

Metodologicky nemůžeme zaručit, že 100% bakterií v naší kultuře účinně přijalo naši molekulu rekombinantní DNA. Zde začíná hrát část plazmidu, který obsahuje rezistenci na antibiotika.

Bakterie, které vstřebaly plazmid, budou tedy rezistentní na určité antibiotikum. Pro jejich výběr stačí použít uvedené antibiotikum a vzít ty, kdo přežili.

4. "Sklizni" protein

Po výběru bakterií pomocí naší rekombinantní DNA pokračujeme v použití enzymatického aparátu hostitele k vygenerování požadovaného proteinového produktu. Jak se bakterie rozmnožují, plazmid se předává jejich potomkům, takže se během dělení neztrácí.

Tento postup používá bakterie jako druh proteinové „továrny“. Později uvidíme, že to byl velmi relevantní postup při vývoji účinných léčebných postupů.

Jakmile je kultura připravena a bakterie produkují velké množství proteinu, je buňka lyzována nebo narušena. Existuje celá řada biochemických technik, které umožňují purifikaci proteinů podle jejich fyzikálně-chemických charakteristik.

V jiném experimentálním kontextu bychom asi neměli zájem o vytvoření proteinu, ale spíše o získání sekvence DNA per se. Pokud by tomu tak bylo, plazmid by se použil k vytvoření více kopií fragmentu, který je předmětem zájmu, aby měl dostatek cílové DNA k provedení příslušných experimentů.

Aplikace

Technologie rekombinantní DNA otevřela nekonečné množství možností v molekulární biologii, biotechnologii, medicíně a dalších souvisejících oblastech. Jeho nejvýznamnější aplikace jsou následující.

Genetická analýza

První aplikace přímo souvisí s laboratořemi molekulární biologie. Technologie rekombinantní DNA umožňuje vědcům porozumět normální funkci genů a generované proteiny mohou být použity v dalším výzkumu.

Farmaceutický průmysl

Proteiny produkované postupem rekombinantní DNA mají uplatnění v medicíně. Dva velmi důležité příklady v oboru jsou lidský inzulín a růstový hormon, který se používá u pacientů, kteří nemají tento protein.

Díky rekombinantní DNA mohou být tyto proteiny generovány bez nutnosti je extrahovat z jiné lidské bytosti, což představuje další metodické komplikace a zdravotní rizika. To pomohlo zlepšit kvalitu života bezpočet pacientů.

Reference

1. Baca, LEL, & Álvarez, CLC (2015). Biologie 2. Grupo Editorial Patria.
2. Cooper, GM, Hausman, RE a Hausman, RE (2000). Buňka: molekulární přístup (svazek 10). Washington, DC: ASM press.
3. Devlin, TM (2004). Biochemie: učebnice s klinickými aplikacemi. Obrátil jsem se.
4. Khan, S., Ullah, MW, Siddique, R., Nabi, G., Manan, S., Yousaf, M., & Hou, H. (2016). Role technologie rekombinantní DNA pro zlepšení života. Mezinárodní časopis o genomice, 2016, 2405954.
5. Mindán, FP, & Mindan, P. (1996). Patologická anatomie. Elsevier Španělsko.
6. Tortora, GJ, Funke, BR, a Case, CL (2007). Úvod do mikrobiologie. Panamerican Medical Ed.
7. The, MJ (1989). Lidský inzulín: první lék technologie DNA. American Journal of Health-System Pharmacy, 46 (11_suppl), S9-S11.