MÜELLER HINTONOVÝ AGAR: ZÁKLAD, PŘÍPRAVA A POUŽITÍ - BIOLOGIE - 2025

Mueller Hinton agar není selektivní, pevné živné prostředí se skládá z masa infuze, peptonu kyselého kaseinu, škrobu, agaru a destilovanou vodou. Toto médium umožňuje vynikající mikrobiální růst pro většinu rychle rostoucích bakterií.

Původně byl vytvořen Johnem Howardem Müellerem a Jane Hintonovou za účelem izolace nutričně náročných bakterií, jako jsou Neisseria gonorrhoeae a Neisseria meningitidis. Díky svým vlastnostem se však ukázalo, že je ideální pro studium citlivosti na antibiotika a poskytuje spolehlivé a reprodukovatelné výsledky.

Antibiogramy (Müeller Hintonův agar). Zdroj: Dr. Graham Beards na en.wikipedia

Proto je Müeller Hinton Agar kultivačním médiem akceptovaným Institutem pro klinické a laboratorní standardy (CLSI) a Evropským výborem pro testování antimikrobiální susceptibility, za účelem provedení testu antimikrobiální susceptibility metodou difúze disků Kirby a Bauere.

Základ

Jako neselektivní nutriční médium je vynikající pro růst většiny patogenních bakterií.

Na druhé straně díky jeho jednoduchému složení se látky snadno rozptylují, což je základní charakteristika testu citlivosti diskovou difúzní metodou.

Další z jeho charakteristik je to, že obsahuje malé množství inhibitorů, které umožňují účinné vyhodnocení sulfonamidů, trimethoprimu a tetracyklinů.

Je však třeba mít na paměti, že médium musí splňovat určité podmínky, aby zajistilo jeho správné fungování, včetně:

Úprava pH, hloubka agaru a vhodná koncentrace thyminu, thymidinu, Ca ⁺⁺, Mg ⁺⁺ a Zn ⁺⁺.

Musíte také vědět, že metodika je standardizovaná, a proto musí být splněny všechny parametry, jako například:

Koncentrace inokula, koncentrace a zachování antibiotických disků, umístění příslušného počtu disků na agar, vzdálenost mezi jedním diskem a druhým, strategické umístění určitých antibiotik, atmosféra, teplota a čas inkubace.

Příprava

Naváží se 37 g dehydratovaného média Müeller Hinton a rozpustí se v 1 litru destilované vody. Zahřívejte médium za stálého míchání, aby se napomohlo rozpuštění. Vařte 1 minutu.

Autokláv se sterilizuje při 121 ° C po dobu 15 minut. Při vyjímání z autoklávu by měla být baňka umístěna do vodní lázně při 50 ° C, aby vychladla. Nalijte 25 až 30 ml do sterilních Petriho misek o průměru 10 cm.

Desky by měly mít průměrnou tloušťku 4 mm (ideální), přičemž je povolen rozsah 3-5 mm.

Pokud je žádoucí připravit krevní agar pomocí agaru Müeller Hinton jako základny, nalijte před podáním na misky 5% sterilní a defibrinovanou jehněčí krev.

Konečné pH média by mělo být mezi 7,2 až 7,4.

Investujte a skladujte v chladničce až do použití. Před použitím nechte destičku ohřát na pokojovou teplotu.

Barva připraveného média je světle béžová.

Aplikace

Používá se k provedení testu antibiogramu nebo antibiotické citlivosti pro nejrychleji rostoucí nenáročné patogeny.

Pokud je agar doplněn krví, používá se mimo jiné k provádění antibiogramu náročných mikroorganismů, jako jsou: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis. Používá se také k izolaci Legionella pneumophila.

Antibiogramová technika

Před provedením antibiogram, bakteriální řešení odpovídá 1,5 x 10 ⁸ buněk musí být připraven.

Za tímto účelem se odeberou 3 až 4 kolonie čisté kultury a suspendují se v sójovém bujónu s tryptikázou nebo v bujónu Müeller Hinton, inkubují se 2 až 6 hodin a koncentrace se upraví sterilním fyziologickým roztokem a porovná se se standardem Mac Farland 0,5%.

Pokud vyžadují mikroorganismy, mohou být kolonie suspendovány přímo do koncentrace 0,5% Mac Farland. Následně se destička Müeller Hinton naočkuje tamponem napuštěným připraveným bakteriálním roztokem.

Za tímto účelem se tampon ponoří do roztoku a přebytečná kapalina se odstraní přitlačením ke stěnám zkumavky. Okamžitě poté je tampon prošel po celé ploše a nezůstanou žádná místa nedotčena, pak se deska mírně otáčí a znovu se naočkuje. Operace se opakuje ještě dvakrát.

Nechte stát 10 minut a poté vložte antibiotické disky sterilními kleštěmi, mezi nimi ponechte mezeru 24 mm. Po umístění každého disku na agar jemně přitlačte každý disk kleštěmi, abyste se ujistili, že dobře drží.

Jakmile je proces ukončen, destička je převrácena a inkubována při aerobióze při 35 - 37 ° C po dobu 16 až 18 hodin. Pokud jde o náročný mikroorganismus, může si zasloužit mikroaerofilii a pokud antibiogram obsahuje oxacilinové disky, měl by se odečíst po 24 hodinách.

K měření průměru každého halou se používá pravítko. Výsledky by se měly zaznamenávat v mm. Získané hodnoty jsou následně korelovány s tabulkami mezních bodů zveřejněných aktuální příručkou CLSI.

Měření inhibičního halo. Zdroj: USCDCP, Pixnio.com

Uveďte jako citlivé (S), střední (I) nebo rezistentní (R).

Antibiotika jsou vybírána podle izolovaného mikroorganismu a typu infekce, kterou produkuje.

Někdy je třeba mít na paměti strategické umístění antibiotik, aby se odhalily fenotypové vzorce rezistence.

Umístění strategického disku na agar Müeller Hinton

U enterobaktérií by měl být disk kyseliny klavulanové umístěn proti cefalosporinům 3. a 4. generace. Rozšíření ve tvaru vejce naznačuje, že kmen je producentem beta-laktamáz s rozšířeným spektrem (ESBL). To znamená, že pacient by neměl být léčen žádnými cefalosporiny.

Fenotypová exprese produkce beta-laktamázy s rozšířeným spektrem (ESBL) v kmeni Escherichia coli. Zdroj: Fotografie pořízená autorem MSc. Marielsa gil

Ve Staphylococcus je důležité umístit erytromycinový nebo azithromycinový disk před clindamycinový disk (D-test).

Rezistentní halo v erythromycinu a zploštění v clindamycinu halo naznačuje, že kmen má kmenem indukovatelnou rezistenci na klindamycin (ICR). To znamená, že léčba klindamycinem nebude účinná.

Při hledání indukovatelných kmenů AMP C u Enterobacteriaceae a některých nefermentujících gramnegativních tyčinek se tazobactan ceftazidim, cefoxitin nebo piperacilinové disky čelí proti disku imipenem ve vzdálenosti 27 mm.

Zploštělý halo v jednom z disků čelících imipenemu ukazuje na přítomnost indukovatelného AMP C.

Při hledání konstitutivního C-AMP je 500 ug cloxacillinového disku čelen ceftazidimu (30 ug) a cefotaximu (30 ug) ve vzdálenosti 25 mm. Rozšířený halo v kterémkoli z cefalosporinů naznačuje pozitivitu.

Cloxacillinový disk může být také nahrazen 9 mm diskem filtračního papíru Whatman č. 6 impregnovaného fenylboritou kyselinou (400 ug) ve vzdálenosti 18 mm. Je interpretován stejně jako ten předchozí.

Nakonec se pro zkoumání produkce metallobetalaktamáz, zejména u Pseudomonas aeruginosa, používá disk impregnovaný 10 ul kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA 750 µg) a kyseliny thioglykolové (SMA 300 µg), která je konfrontována s disky imipenem a meropenem, ve vzdálenosti 15 mm.

Test je pozitivní, pokud dojde k rozšíření imipenemových nebo meropenemových halos směrem k disku EDTA / SMA. Tento výsledek musí být potvrzen modifikovaným Hodgeovým testem.

Tato metoda spočívá v očkování kmene Escherichia coli ATCC 25922 na Müeller Hintonovu destičku. Imipenemový disk se umístí do středu destičky a poté se z disku na periférii vytvoří pruh s podezřením na kmeny P. aeruginosa. Na destičku lze testovat až 4 kmeny.

Zkouška bude pozitivní, pokud je kolem značky stretch zóna zkreslení imipenem halo.

Příčiny chybných výsledků

- Špatně konzervované antibiotické disky mohou způsobit falešnou rezistenci. Například oxacillinový disk je velmi citlivý na změny teploty.

- pH média pod uvedeným (kyselým) prostředím produkuje menší halogeny v aminoglykosidech a makrolidech (riziko falešné rezistence) a větší halosy v penicilinu, tetracyklinu a novobiocinu (riziko falešné citlivosti).

- Pokud je pH vyšší než uvedené (zásadité), jsou výše popsané účinky obráceny.

-Média s vysokými koncentracemi thyminu a thymidinu mají vliv tím, že významně snižují inhibiční halogeny sulfonamidů a trimethoprimu.

-Vysoké koncentrace vápníku a hořčíku způsobují falešnou odolnost aminoglykosidů, polymyxinu B a tetracyklinů proti kmenům Pseudomonas aeruginosa.

- Nízké koncentrace vápníku a hořčíku vyvolávají falešnou citlivost aminoglykosidů, polymyxinu B a tetracyklinů na kmeny Pseudomonas aeruginosa.

- Přítomnost zinku ovlivňuje výsledky karbapenemových disků (imipenem, meropenem a ertapenem).

- Tloušťka média pod 3 mm povede k falešným výsledkům citlivosti, zatímco tloušťka nad 5 povede k falešnému odporu.

- Mobilizace disků v antibiogramu způsobí deformované halo, protože výtok antibiotik je okamžitý.

- Velmi slabé inokulum ovlivňuje výsledky, protože nebude existovat rovnoměrný nebo souvislý růst v agaru, což je nezbytná podmínka, aby bylo možné měřit inhibiční halopy, navíc ke skutečnosti, že halo může poskytnout větší než normální.

-Pouze načtená inokula může poskytnout halos menší než je obvyklé.

- Nerespektování vzdálenosti mezi disky způsobí, že se jeden halo překrývá s druhým a nelze je správně přečíst.

- Inkubace s CO ₂ zvyšuje velikost halos disků tetracyklin a meticilin.

- Inkubace při teplotách pod 35 ° C vytváří větší halo.

- Přidáním krve se zmenší velikost halosulfonu.

Omezení

Citlivost antibiotika prokázaná v antibiogramu proti mikroorganismu (in vitro) není zárukou, že bude fungovat in vivo.

QA

Aby se vědělo, zda médium obsahuje dostatečné množství tyminu, musí být vysazen kmen Enterococcus faecalis ATCC 29212 a musí být testována citlivost na trimethoprim sulfamethoxazol (SXT), aby byl uspokojivý, musí být halo větší nebo> 20 mm.

Reference

1. "Müller-Hintonův agar." Wikipedia, encyklopedie zdarma. 16. listopadu 2018, 12:23 UTC. 27. ledna 2019, 04:22
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey a Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
3. Cona E. Podmínky pro dobrou studii citlivosti pomocí agarového difúzního testu. Rev Chil Infect, 2002; 19 (2): 77-81
4. Difco Francisco Soria Melguizo Laboratory. Müeller Hintonův agar s 5% ovčí krve. 2009. K dispozici na adrese:
5. BD Müeller Hinton II Agar Laboratory. 2017. K dispozici na:.bd.com
6. Britannia Laboratories. Müeller Hintonův agar. 2015.K dispozici na: britanialab.com
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
8. Martínez-Rojas D. Betalaktamázy typu AmpC: Obecnosti a metody fenotypové detekce. Soc. Ven. Microbiol. 2009; 29 (2): 78-83. K dispozici na adrese: scielo.org.
9. Perozo A, Castellano M, Ling E, Arraiz N. Fenotypová detekce metallobetalaktamáz v klinických izolátech Pseudomonas aeruginosa. Kasmera, 2012; 40 (2): 113-121. K dispozici na adrese: scielo.org.