KREVNÍ AGAR: ZDŮVODNĚNÍ, POUŽITÍ A PŘÍPRAVA - BIOLOGIE - 2025

Krevní agar je pevné kultivační médium obohacené rozdíl, ale neselektivní. Používá se pro regeneraci a růst velkého množství mikroorganismů z klinických vzorků nebo pro subkultury.

Pro nasazení většiny klinických vzorků získaných v laboratoři by měl být zařazen klasický krevní agar; s výjimkou vzorků stolice, pokud to není užitečné, pokud není připraveno s určitými úpravami.

Deska krevního agaru

Toto kultivační médium v ​​podstatě sestává z obohaceného základního agaru a 5% krve. Agarová báze se může lišit podle potřeb, ale bude sestávat hlavně z peptonů, aminokyselin, vitamínů, masového extraktu, chloridu sodného, ​​agaru.

Pokud jde o krev, obvykle se vyžaduje kontakt s viváriem, aby se získala krev ze zvířat, jako jsou ovce, králíci nebo koně. To však není vždy možné a někdy se používá lidská krev.

Médium s krevním agarem lze připravit v laboratoři nebo je lze zakoupit v hotovém balení od specializovaných společností. Příprava tohoto média je jednou z nejcitlivějších, jakákoli nedbalost při jeho přípravě povede ke znečištění šarže.

Proto musí být přijata všechna možná preventivní opatření a na konci musí být provedena kontrola kvality inkubací destičky při 37 ° C 1 na každých 100 připravených.

Základ

Staphylococcus aureus kultivovaný na krevním agaru. Čtení Nathana na Flickru Nathan R. na Twitteru, přes Wikimedia Commons Již bylo zmíněno, že krevní agar má charakter obohaceného, ​​diferencovaného a neselektivního média. Základ pro každou z těchto vlastností je vysvětlen níže.

Krevní agar je obohacené médium, protože jako hlavní přísada obsahuje 5-10% krve na bázi agaru. Obě sloučeniny obsahují mnoho živin a tato vlastnost umožňuje růst většiny kultivovatelných bakterií.

K tomuto růstu dochází bez omezení; z tohoto důvodu je neselektivní. Pokud se však do tohoto média přidají sloučeniny, které brání růstu některých mikroorganismů a zvýhodňují růst jiných, stává se selektivní. To je případ, pokud jsou přidány určité typy antibiotik nebo fungicid.

Podobně je krevní agar diferenciálním médiem, protože umožňuje rozlišit 3 typy bakterií: beta-hemolytické, alfa-hemolytické a gama-hemolytické.

Beta-hemolytika jsou ta, která mají schopnost úplně lýzovat nebo lámat červené krvinky a kolem kolonií vytvářet jasný halo, proto produkují ß nebo ß-hemolýzu a mikroorganismy se nazývají ß-hemolytické.

Příklady ß-hemolytických bakterií jsou Streptococcus pyogenes a Streptococcus agalactiae.

Alfa-hemolytika jsou ta, která provádějí částečnou hemolýzu, kde se hemoglobin oxiduje na methemoglobin, čímž se kolem kolonií vytvoří nazelenalé zbarvení. Tento jev je znám jako α nebo α-hemolýza a bakterie jsou klasifikovány jako α - hemolytické.

Příklady a-hemolytických bakterií jsou Streptococcus pneumoniae a Streptococcus skupiny viridans.

Konečně existují tzv. Gama-hemolytické nebo nehemolytické bakterie. Ty rostou na agaru, aniž by na něm vyvolaly změny, což je účinek známý jako y -hemolýza a mikroorganismy jsou y -hemolytické.

Příklad y-hemolytických bakterií: některé kmeny skupiny D Streptococcus (Streptococcus bovis a Enterococcus faecalis).

Aplikace

Médium pro kultivaci krevního agaru je jedním z nejčastěji používaných v mikrobiologické laboratoři.

Mezi mikroorganismy schopné růst v krevním agarovém médiu patří: přísné aerobní, fakultativní, mikroaerofilní, anaerobní, grampozitivní nebo gramnegativní bakterie, rychle rostoucí nebo pomalu rostoucí bakterie.

Rostou také některé nutričně náročné nebo náročné bakterie, houby a kvasinky. Rovněž je užitečné pro subkultivaci nebo reaktivaci kmenů, které jsou metabolicky velmi slabé.

Výběr krevního typu a základního agaru se však bude lišit v závislosti na pravděpodobném mikroorganismu, u kterého existuje podezření na regeneraci, a na použití, ke kterému se destička použije (kultura nebo antibiogram).

Volba krevního typu

Krev může být jehněčí, králík, kůň nebo člověk.

Nejvíce doporučovaná je krev jehněčího, až na některé výjimky. Například k izolaci druhů Haemophilus, kde je doporučenou krví kůň nebo králičí krev, protože jehněčí krev obsahuje enzymy, které inhibují faktor V.

Nejméně doporučovaný je člověk, je však nejpoužívanější, snad proto, že je nejsnazší získat.

Krev musí být defibrinována, získána bez jakéhokoli typu doplňkové látky a od zdravých zvířat. Pro použití lidské krve je třeba vzít v úvahu několik faktorů:

Pokud krev pochází od jedinců, kteří měli bakteriální infekce, budou mít specifické protilátky. Za těchto podmínek je růst některých bakterií pravděpodobně inhibován.

Pokud je získán z krevní banky, obsahuje citrát a určité bakterie nemusí v jeho přítomnosti růst. Na druhé straně, pokud krev pochází od pacientů, kteří užívají antibiotika, může být růst citlivých bakterií inhibován.

A pokud je krev od diabetika, přebytek glukózy narušuje správný vývoj hemolytických vzorců.

Výběr typu základního agaru

Základní agar použitý pro přípravu krevního agaru může být velmi široký. Mezi ně patří: živný agar, mozkový infuzní agar, tryptikázový sójový agar, Müeller Hintonův agar, Thayer Martinův agar, Columbia agar, Brucella agar, Campylobacter agar atd.

Použití krevního agaru podle základního média použitého pro jeho přípravu

Živný agar

Tato báze je nejméně využívaná, protože bude pěstovat hlavně nenáročné bakterie, jako jsou enterální bacily, Pseudomonas sp, S. aureus, Bacillus sp. Nedoporučuje se izolovat Streptococcus.

Agar pro infuzi mozku a srdce (BHI)

Je to jedna z nejrozšířenějších základů krevního agaru, protože obsahuje potřebné živiny pro růst většiny bakterií, včetně Streptococcus sp a dalších náročných bakterií. Přestože není vhodné sledovat hemolýzu.

K této základně se obvykle používá jehněčí krev.

Mohou být také připraveny varianty krevního agaru, kde jsou přidány další sloučeniny pro izolaci určitých mikroorganismů. Například k izolaci Francisella tularensis lze použít mozkový infuzní agar doplněný králičí krví, cystinem a glukózou.

Zatímco s cystin telluritem je užitečný pro izolaci Corynebacterium diphteriae. Může být použita lidská nebo jehněčí krev.

S první beta-hemolýzou bude viděn jako úzký halo, zatímco s druhým bude halo mnohem širší.

Stejně tak se tato báze společně s bacitracinem, kukuřičným škrobem, koňskou krví a dalšími doplňky obohacování (IsoVitaleX) používá k izolaci rodu Haemophilus sp ze vzorků dýchacích cest.

Pokud se také přidá kombinace antibiotik chloramfenikol - gentamicin nebo penicilin - streptomycin s koňskou krví, je ideální pro izolaci náročných patogenních hub, a to i s vyšším výnosem než glukózový agar Sabouraud. Je zvláště užitečný při izolaci Histoplasma capsulatum.

Tryptikáza sojový agar

Tato báze je nejvíce doporučovaná pro lepší sledování hemolytického vzorce a pro provádění diagnostických testů, jako jsou taxony optoquinu a bacitracin. Rutinně se používá klasický krevní agar.

S touto základnou můžete také připravit speciální krevní agar pro Corynebacterium diphteriae s cystinovým teluritem a jehněčí krví .

Rovněž kombinace tohoto agaru s jehněčí krví a kanamycin-vankomycinem je ideální pro růst anaerobů, zejména Bacteroides sp.

Müeller Hintonův agar

Tato báze doplněná krví se používá k provádění antibiogramu náročných mikroorganismů, jako je Streptococcus sp.

Je také užitečná pro izolaci bakterií, jako je Legionella pneumophila.

Thayer Martin Agar

Toto médium je ideální jako základ pro krevní agar v případě podezření na rod Neisseria, zejména na Neisseria meningitidis, protože N. gonorrhoeae neroste na krevním agaru.

Používá se také k testování citlivosti na Neisseria meningitidis.

Agar Columbia

Tato báze je vynikající pro nasazení vzorků biopsie žaludku na Helicobacter pylori.

Médium se připravuje přidáním 7% jehněčí krve defibrinované antibiotiky (vankomycin, trimethoprim, amfotericin B a cefsulodin), aby se omezil růst dalších typů bakterií, které mohou být přítomny.

Stejná báze doplněná lidskou nebo jehněčí krví, kyselinou nalidixovou a kolistinem je užitečná pro izolaci Gardnerella vaginalis. Je také ideální pro posouzení antimikrobiální citlivosti na antibiotika stejného mikroorganismu.

Kromě toho se používá k přípravě krevního agaru pro kultivaci anaerobů, přidání aminoglykosidů a vankomycinu.

Tato báze umožňuje správné pozorování hemolytických vzorců.

Brucella agar

Toto médium používané jako základ pro krevní agar spolu s přídavkem vitamínu K je ideální pro kultivaci anaerobních bakterií. V tomto případě se doporučuje použití jehněčí krve.

Campylobacter agar

Campylobacter agar doplněný 5% ovčí krví a 5 antibiotiky (cefalothin, amfotericin B, trimethoprim, polymyxin B a vankomycin), je médium používané k izolaci Campylobacter jejuni ve vzorcích stolice.

Příprava

Každý komerční dům přináší pokyny k přípravě litru kultivačního média na zadní stranu nádoby. V závislosti na vybraném základním agaru mohou být provedeny odpovídající výpočty pro přípravu požadovaného množství.

Vážení a rozpuštění

Základní agar je dehydratován (prášek), proto musí být rozpuštěn v destilované vodě upravené na pH 7,3.

Množství označené zvoleným základním agarem se zváží a rozpustí se v odpovídajícím množství vody v baňce, potom se zahřívá na mírné teplo a míchá se rotačními pohyby, dokud se veškerý prášek nerozpustí.

Sterilizovat

Po rozpuštění sterilizujte v autoklávu při 121 ° C po dobu 20 minut.

Krevní agregát

Při opuštění autoklávu se baňka nechá vychladnout, dokud se teplota pohybuje v rozmezí 40 až 50 ° C; Je to teplota, kterou lidská kůže podporuje, a současně agar ještě neztuhnul.

Za tímto účelem se baňka dotkne rukou a pokud je teplo přijatelné, je ideální teplota přidat odpovídající množství defibrinované krve (50 ml na každý litr agaru). Jemně promíchejte, aby se homogenizoval.

Průchod agregace krve je rozhodující, protože pokud se tak stane, když je médium velmi horké, červené krvinky se rozpadnou a médium se nepoužije k pozorování hemolýzy.

Pokud je přidán příliš chladný, zhlukne se a povrch média nebude hladký, aby umožnil správné hodnocení.

Nalijte do Petriho misek

Ihned po homogenizaci krve podávejte ve sterilních Petriho miskách. Do každé Petriho misky se nalije přibližně 20 ml. Tento postup se provádí v laminární průtokové kapotě nebo v blízkosti hořáku.

Při podávání krevního agaru v Petriho miskách by na povrchu destičky neměly zůstat žádné vzduchové bubliny. Pokud k tomu dojde, plamen Bunsenova hořáku rychle prochází deskou, aby je odstranil.

Destičky se nechají ztuhnout a skladují se v chladničce (2-8 ° C) převrácené až do použití. Před použitím destiček na krevní agar musí být temperovány (nechat dosáhnout pokojové teploty), aby mohly být naočkovány.

Připravené destičky trvají přibližně 1 týden.

Reference

1. Bayona M. Mikrobiologické podmínky pro kultivaci Helicobacter pylori. Rev Col Gastroenterol 2013; 28 (2): 94-99
2. García P, Paredes F, Fernández del Barrio M. (1994). Praktická klinická mikrobiologie. University of Cadiz, 2. vydání. UCA Publications Service.
3. "Krevní agar." Wikipedia, encyklopedie zdarma. 10. prosince 2018, 14:55 UTC. 27. prosince 2018, 01:49 en.wikipedia.org.
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey a Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Argentina. Editorial Panamericana SA
5. Laboratorní veterinární diagnostické centrum CEDIVET. Guatemala. K dispozici na adrese: trensa.com.
6. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. (5. vydání). Argentina, Editorial Panamericana SA