LÖWENSTEIN-JENSEN MEDIUM: ZALOŽENÍ, PŘÍPRAVA A POUŽITÍ - BIOLOGIE

Lowenstein-Jensen médium je selektivní pevné médium pro izolaci a vývoj bakterií rodu Mycobacterium, jako je Mycobacterium tuberculosis, M. avium, mimo jiné, s výjimkou druhu leprae, která není kultivovatelných.

Bakterie rodu Mycobacterium nerostou v konvenčních kultivačních médiích, proto bylo nutné pro jejich izolaci navrhnout speciální médium. Původní médium vytvořil Löwenstein a později jej upravil Jensen.

Löwenstein-Jensenovo médium s koloniemi Mycobacterium tuberculosis. Zdroj: Agarwal et al / BioMed Central Ltd., s laskavým svolením Biology Image Library

Tato modifikace spočívala v eliminaci kongo červeného barviva a jeho nahrazení vyšší koncentrací malachitové zeleně. Změnil také koncentrace citranu hořečnatého a fosforečnanu draselného.

Löwenstein-Jensenovo médium v současné době obsahuje bramborový škrob, asparagin, citrát hořečnatý, fosforečnan draselný, síran hořečnatý, malachitovou zeleň, kyselinu nalidixovou, cykloheximid, lincomycin, rozšlehaná vejce, glycerin a vodu.

Mykobakterie jsou obvykle izolovány z míst, která nejsou sterilní, jako je sputum, moč, abscesy. To znamená, že většina vzorků bude obsahovat obvyklou mikrobiotu oblasti plus patogen.

Proto médium Löwenstein-Jensen obsahuje ve svém složení řadu inhibitorů představovaných malachitovou zelení, antibiotiky a antimykotiky.

Kromě toho musí být vzorky, které pocházejí z nesterilních míst, dekontaminovány a neutralizovány před naočkováním do Löwenstein-Jensenova média.

Základ

Přítomnost vajec a glycerinu v médiu Löwenstein-Jensen stimuluje růst mykobakterií, protože poskytují mastné kyseliny a proteiny nezbytné pro vývoj těchto mikroorganismů.

Médium Löwenstein-Jensen obsahuje malachitovou zeleň, která je inhibitorem doprovodné mikrobioty. Obsahuje však také kyselinu nalidixovou (35 µg / ml), která inhibuje Gram negativní mikrobiotu, cykloheximid (400 ug / ml), který inhibuje saprofytické houby a kvasinky, a lincomycin (2 µ / ml), který inhibuje Gram pozitivní mikrobiotu.

Některé komerční společnosti dávají přednost přidání následující kombinace antibiotik: polymyxin B 200 000 jednotek / l, amfotericin B 10 mg / l, karbenicilin 50 mg / l a trimethoprim 10 mg / L.

Toto médium neobsahuje agar, proto k tuhnutí média dochází v důsledku koagulace albuminu přítomného ve vejci během sterilizace.

Příprava

Navážte 37,3 g dehydratovaného média v 600 ml destilované vody, do které bylo dříve přidáno 12 ml glycerolu. Směs se zahřívá za stálého míchání, dokud se úplně nerozpustí. Médium se autoklávuje při 121 ° C po dobu 15 minut.

Na druhou stranu by se za aseptických podmínek měla připravit homogenní suspenze 1000 ml čerstvých vajec. Přidejte vaječnou suspenzi k 600 ml média připraveného při teplotě 50 - 60 ° C, vyhněte se vzduchovým bublinám.

Antibiotické roztoky se přidávají také po sterilizaci v autoklávu.

Nalijte médium do sterilních zkumavek se šroubovacím uzávěrem. Zkumavky zahřívejte při 85 ° C po dobu 45 minut ve šikmé poloze.

Barva připraveného média je akvamarinová zelená a v důsledku přítomnosti vaječných lipidů může vykazovat bělavé skvrny.

PH média musí být 7,2 ± 0,2

Zkumavky skladujte až do použití v chladničce a chráněné před přímým světlem. Před výsevem temperujte.

Tam je modifikace média volala “Gruft modifikace Löwenstein Jensen”. Tato obsahuje stejné sloučeniny jako klasické médium, ale přidává se RNA-5 mg / 100 ml a jako inhibitory obsahuje malachitovou zeleň 0,025 g / 100 ml, penicilin 50 U / ml a kyselinu nalidixovou 35 ug / ml.

Aplikace

Médium Löwenstein-Jensen se používá k izolaci mykobakterií z různých typů vzorků. Ziehl-Neelsenovo barvení se doporučuje pro všechny vzorky, u nichž existuje podezření na přítomnost mykobakterií.

Některé vzorky pocházejí ze sterilních stránek, jiné ne. Nesterilní vzorky musí být podle potřeby dekontaminovány:

Sputum

Vzorky sputa by měly být dekontaminovány následujícím způsobem: stanovte množství vzorku sputa v ml a do vzorku přidejte stejné množství 4% NaOH a inkubujte při 37 ° C.

Směs se třepe často do 30 minut. Následně se odstřeďuje při 3000 RPM po dobu 30 minut.

Supernatant zlikvidujte přes fenolický dezinfekční roztok. K výsevu použijte sediment, ale nejprve musí být neutralizováno pH.

Pro neutralizaci sediment, 5% H ₂ SO ₄ se používá v přítomnosti červeného indikátoru fenolové, dokud se nedosáhne neutrálního pH, které způsobuje lososovou barvu.

Výplach žaludku, výplach průdušek a aspirace průdušek

V tomto případě musí být vzorek odstřeďován při 3000 ot / min po dobu 30 minut. Supernatant se odstraní a použije se peleta. K dekontaminaci sedimentu přidejte 3 ml 4% NaOH a často míchejte při 37 ° C po dobu půl hodiny.

Znovu odstřeďte, supernatant se odstraní a použije se peleta. Ten musí být neutralizován, jak je vysvětleno ve vzorku sputa.

Moč

Nechte vzorek usadit se v lednici po dobu 24 hodin. Oddělte supernatant. Zbývající peleta by měla být odstřeďována po dobu 30 minut při 3000 RMP. Supernatant znovu zlikvidujte a peletu rekonstituujte 3 ml sterilního fyziologického roztoku.

Přidejte 3 ml 4% NaOH a pokračujte k dekontaminaci a neutralizaci, jak je popsáno výše.

Ascitická tekutina, pleurální tekutina, cerebrospinální tekutina

V tomto typu vzorku se odstředí a supernatant se odstraní. Proveďte Gram na sedimentu nebo pozorujte přímo pod mikroskopem; Pokud bakterie nejsou pozorovány, není nutný dekontaminační krok ani neutralizační krok.

V tomto případě lze vzorek naočkovat přímo pomocí sedimentu. Pokud existují bakterie, pokračujte v dekontaminaci a neutralizujte, jak je popsáno výše.

Biopsie

K tomuto typu vzorku musí být přidáno 5 ml destilované vody pro pozdější odstředění při 1500 ot / min po dobu 10 minut. Odstraňte supernatant a peletu znovu odstřeďte při 3500 ot / min po dobu 30 minut. Použijte sediment k zasetí kultivačního média.

Tampón hltanu

Tampón by měl být umístěn do sterilní zkumavky obsahující stejné díly destilované vody a 4% NaOH. Tampón musí být přitlačen ke stěnám zkumavky tak, aby byl vzorek zředěn v kapalině. Odstřeďte a použijte sediment. Sediment neutralizujte, jak již bylo popsáno.

Zaseté

Médium Löwenstein-Jensen se naočkuje přidáním 0,5 ml vzorku na povrch média. Otočte zkumavku, aby se vzorek distribuoval do média. Nepoužívejte platinové držadlo.

Druhou zkumavku obsahující médium Stonebrink lze naočkovat, aby se izoloval Mycobacterium bovis a další druhy, které nerostou na médiu Löwenstein-Jensen.

Inkubace

Inokulované zkumavky se aerobně inkubují při 37 ° C, s víčkem mírně uvolněným a nakloněným při přibližně 5 ° a chráněným před světlem. Prostředí lze obohatit o 5–10% oxidu uhličitého. Kultury kontrolujte dvakrát týdně, dokud se neobjeví kolonie.

Po absorpci vzorku se uzávěry utáhnou. Maximální doba inkubace je 8 týdnů, pokud po této době nedochází k růstu, je hlášena jako negativní.

QA

Jako kontrola kvality lze použít následující kmeny:

Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294, Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Cryptococcus of 32ccus of Ccustoccus, Cccfccoccus, Cccfccccccccccccc

Vynikající vývoj se očekává u prvních tří zmíněných druhů, u M. fortuitum by růst měl být dobrý, zatímco u M. bovis se očekává malý nebo žádný růst. Mezitím musí být úplně inhibovány jiné druhy než rod Mycobacterium.

Omezení

Připravené médium musí být chráněno před světlem, dlouhodobé vystavení světlu způsobí, že se médium změní ze zelené na modrou, v tomto případě již médium nelze použít. Důvodem je, že malachitová zelená je fotocitlivá.

Médium, protože obsahuje vejce, může být snadno kontaminováno, pokud s ním není manipulováno asepticky. Může být rozpuštěn, pokud je kontaminován proteolytickými bakteriemi.

Pěstování a manipulace s bakteriemi rodu Mycobacterium vyžaduje kvalifikovaný personál, který si je vědom opatření biologické bezpečnosti, která musí být dodržována, aby nedošlo ke kontaminaci nebo kontaminaci ostatních.

HCI by neměla být používána v neutralizačním kroku kvůli tvorbě chloridu sodného, který může být toxický pro Kochův bacil.

Vzorky by měly být uchovávány v chladu a chráněny před světlem, aniž by byly zpracovávány.

Odkaz

Francisco Soria Melguizo Laboratories. 2009. Selektivní médium Löwenstein-Jensen. K dispozici na adrese: f-soria.es
Britannia Laboratories. 2017. Löwenstein-Jensen medium. K dispozici na adrese: britanialab.com.
Neogen Laboratories. Löwenstein-Jensen střední. K dispozici na adrese: foodsafety.neogen.com.
"Löwenstein-Jensen medium." Wikipedia, encyklopedie zdarma. 20. listopadu 2018, 15:15 UTC. 24. dubna 2019, 18:34. wikipedia.org
Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologická diagnostika. 5. ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey a Scott Mikrobiologická diagnostika. 12 ed. Editorial Panamericana SA Argentina.
Mac Faddin J. (2003). Biochemické testy pro identifikaci bakterií klinického významu. 3. ed. Editorial Panamericana. Buenos Aires. Argentina.

LÖWENSTEIN-JENSEN MEDIUM: ZALOŽENÍ, PŘÍPRAVA A POUŽITÍ - BIOLOGIE - 2025