DNA MICROARRAYS: POSTUP A APLIKACE - BIOLOGIE - 2025

DNA microarray, také volal DNA čipu nebo DNA microarray, se skládá z řady fragmentů DNA ukotven k fyzické podpory proměnné materiálu, a to buď z plastu nebo skla. Každý kus DNA představuje sekvenci komplementární ke specifickému genu.

Hlavním cílem mikročipů je srovnávací studie exprese určitých požadovaných genů. Například je běžné, že se tato technika aplikuje na dva vzorky - jeden ve zdravém stavu a jeden patologický - s cílem identifikovat, které geny jsou exprimovány a které nejsou ve vzorku se stavem. Uvedeným vzorkem může být buňka nebo tkáň.

Paphrag na anglické Wikipedii (Převedeno z en.wikipedie na Commons.), Přes Wikimedia Commons

Obecně lze expresi genů detekovat a kvantifikovat díky použití fluorescenčních molekul. Manipulaci s čipy provádí ve většině případů robot a velké množství genů lze analyzovat současně.

Tato nová technologie je užitečná pro celou řadu oborů, od lékařské diagnostiky po různá studia molekulární biologie v oblasti proteomiky a genomiky.

Z čeho se skládá?

Microarrays DNA (kyselina deoxyribonukleová) je sada specifických segmentů DNA připojených k pevné matrici. Tyto sekvence jsou komplementární s geny, které chtějí být studovány, a tam může být až 10.000 genů na cm ².

Tyto vlastnosti umožňují systematické a masivní studium genové exprese organismu.

Informace, které buňka potřebuje, jsou kódovány v jednotkách zvaných „geny“. Některé geny obsahují pokyny pro tvorbu základních biologických molekul nazývaných proteiny.

Gen je exprimován, pokud je jeho DNA přepsána na molekulu messenger RNA a exprese genu se může lišit v závislosti na úrovni transkripce tohoto segmentu DNA. V některých případech může změna projevu naznačovat onemocnění.

Princip hybridizace umožňuje provoz mikročipů. DNA je molekula tvořená čtyřmi typy nukleotidů: adenin, thymin, guanin a cytosin.

Aby se vytvořila struktura dvojité spirály, adeninové skupiny s thyminem a cytosin s guaninem. Vodíkové vazby tak mohou být spojeny dva komplementární řetězce.

Druhy mikročipů

Pokud jde o strukturu mikročipů, existují dvě variace: komplementární DNA nebo oligonukleotidy vyrobené na zakázku a komerční mikročipy o vysoké hustotě vyrobené komerčními společnostmi, jako je Affymetrix GeneChip.

První typ mikročipu umožňuje analýzu RNA ze dvou různých vzorků na jediném čipu, zatímco druhá varianta je komerčního typu a má velké množství genů (například Affymetrix GeneChip má asi 12 000 lidských genů), což umožňuje analyzovat jeden vzorek.

Proces

Izolace RNA

Prvním krokem při provádění experimentu s použitím technologie microarray je izolace a čištění molekul RNA (může to být messenger RNA nebo jiné typy RNA).

Pokud chcete porovnat dva vzorky (mezi jinými zdravé vs. nemocné, kontrolní vs. ošetření), musí být provedena izolace molekuly v obou tkáních.

Produkce a značení cDNA

Následně se RNA podrobí procesu reverzní transkripce v přítomnosti značených nukleotidů a získá se tak komplementární DNA nebo cDNA.

Štítek může být fluorescenční a musí být rozlišitelný mezi dvěma tkáněmi, které mají být analyzovány. Tradičním způsobem se používají fluorescenční sloučeniny Cy3 a Cy5, protože emitují fluorescenci při různých vlnových délkách. V případě Cy3 je to barva blízká červené a Cy5 odpovídá spektru mezi oranžovou a žlutou.

Hybridizace

CDNA jsou smíchány a inkubovány v DNA mikročipu, aby se umožnila hybridizace (tj. Dojde k vazbě) cDNA z obou vzorků s částí DNA imobilizovanou na pevném povrchu mikročipu.

Vyšší procento hybridizace se sondou v mikročipu je interpretováno jako vyšší tkáňová exprese odpovídající mRNA.

Čtení systému

Kvantifikace exprese se provádí začleněním čtecího systému, který přiřazuje barevný kód množství fluorescence emitované každou cDNA. Například, pokud se k označení patologického stavu použije červená a ve vyšší části hybridizuje, bude převažující červená složka.

S tímto systémem může být známa nadměrná exprese nebo represe každého genu analyzovaného v obou vybraných podmínkách. Jinými slovy, transkriptom vzorků hodnocených v experimentu může být znám.

Larssono, z Wikimedia Commons

Aplikace

V současné době jsou microarrays považovány za velmi silné nástroje v oblasti medicíny. Tato nová technologie umožňuje diagnostiku nemocí a lepší pochopení toho, jak je genová exprese modifikována za různých zdravotních podmínek.

Kromě toho umožňuje srovnání kontrolní tkáně a tkáně ošetřené určitým lékem, aby bylo možné studovat účinky možného lékařského ošetření.

Za tímto účelem se normální a nemocný stav porovnávají před a po podání léku. Studiem účinku léku na genom in vivo máme lepší přehled o jeho mechanismu účinku. Rovněž lze pochopit, proč některé konkrétní léky vedou k nežádoucím vedlejším účinkům.

Rakovina

Rakovina je na vrcholu seznamů studovaných nemocí s DNA mikročipy. Tato metodika byla použita pro klasifikaci a prognózu onemocnění, zejména v případech leukémií.

Výzkumné pole tohoto stavu zahrnuje kompresi a charakterizaci molekulárních bází rakovinných buněk za účelem nalezení vzorů genové exprese, které vedou k selhání v regulaci buněčného cyklu a v procesech buněčné smrti (nebo apoptózy).

Jiné nemoci

Pomocí mikročipů bylo možné objasnit rozdíly v expresních profilech genů ve zdravotních stavech alergií, primárních imunodeficiencí, autoimunitních chorob (jako je revmatoidní artritida) a infekčních chorob.

Reference

1. Bednar, M. (2000). Technologie a aplikace microarray DNA. Medical Science Monitor, 6 (4), MT796-MT800.
2. Kurella, M., Hsiao, LL, Yoshida, T., Randall, JD, Chow, G., Sarang, SS,… & Gullans, SR (2001). DNA microarray analýza složitých biologických procesů. Journal of American Society of Nephrology, 12 (5), 1072-1078.
3. Nguyen, DV, Bulak Arpat, A., Wang, N., & Carroll, RJ (2002). Experimenty s microarray DNA: biologické a technologické aspekty. Biometrics, 58 (4), 701-717.
4. Plous, CV (2007). DNA microarrays a jejich aplikace v biomedicínském výzkumu. CENIC Magazine. Biological Sciences, 38 (2), 132-135.
5. Wiltgen, M., & Tilz, GP (2007). Analýza microarray DNA: principy a klinický dopad. Hematology, 12 (4), 271-287.